背景[1-3]
小鼠角膜基质细胞是存在于小鼠角膜中层的结缔组织，这些细胞是呈正方形的，具有完全透明的特点。这些细胞可以被提取并进行体外培养，以用于各种生物医学研究。
对于体外培养小鼠角膜基质细胞，一般需要提供特定的培养环境，包括适当的培养基、血清以及生长因子等，以促进细胞的生长和维持其正常的生理状态。同时，还需要注意维持培养温度和湿度等参数，确保细胞的正常生长和繁殖。
在进行小鼠角膜基质细胞的提取和培养时，需要注意操作细节和卫生条件，以避免外界因素的干扰和污染。同时，还需要进行必要的细胞鉴定和安全性检测，以确保细胞的纯度和安全性。
鼠角膜基质细胞
小鼠角膜位于眼球前壁的一层透明膜，约占纤维膜的前1/6，从后面看角膜呈正圆形，从前面看为横椭圆形。角膜厚度各部分不同，中央部最薄。角膜分为五层，由前向后依次为：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层。
小鼠角膜基质为中层结缔组织，完全透明，角膜基质层中的主要细胞成分是角膜基质细胞，它能合成和分泌纤维，并且对胶原束的排列和平衡都起作用。
小鼠角膜基质细胞处理:
(1)冻存小鼠角膜基质细胞的复苏:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8mL完全培养基的培养瓶(或皿)中37℃培养过夜。显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
(2)小鼠角膜基质细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法:
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加入0.25%(w/v)胰蛋白酶-0.53mM EDTA于培养瓶中(T25瓶1-2mL,T75瓶2-3mL),置于37℃培养箱中消化1-2分钟(难消化的细胞可以适当延长消化时间),然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加入3-4mL含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶中,添加6-8mL按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力,后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
(3)小鼠角膜基质细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
下面以T25瓶为例:
(1)细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中,可使用血球计数板计数,来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10~1×10个活细胞/mL。
(2)1000rpm离心3-5min,去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞,按每1mL冻存液含1×10~1×10个活细胞/mL分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中,标注好名称、代数、日期等信息。
(3)将要冻存的细胞置于程序降温盒中,-80℃冰箱中过夜,之后转入液氮容器中储存,同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
应用[4-5]
小鼠角膜基质细胞可以用于小鼠角膜基质细胞的间充质干细胞样表型和多向分化潜能以及抑制树突状细胞成熟的功能
研究表明,位于角膜中央区的DCs完全处于未成熟状态,而位于角膜周边区的DCs则大多处于成熟状态。局部微环境对DCs的成熟状态发挥着重要的调节功能。所以,我们推测CSCs可能具有影响角膜内DCs成熟状态的功能,然而至今尚未见相关报道。因此,本研究旨在探索如何在体外有效扩增小鼠CSCs以及对CSCs的间充质干细胞特性和抑制DCs成熟的功能进行探讨。如下:
小鼠角膜基质细胞的提取、鉴定以及培养扩增目的:研究使用KSFM培养基能否获取具有增殖能力且保持生物学特性不变的小鼠CSCs。
方法:将中央区角膜置于EDTA液(20mmol/L)内孵育45min后,用手术显微镊小心剥离角膜上皮层以及内皮层,并将获取的角膜基质置于含300U/mL I型胶原酶的溶液中消化4h。离心后采用DMEM基础培养基、DMEM完全培养基(含10%FBS)以及KSFM培养基重悬细胞,接种于培养瓶内常规培养,并采用含1U/mL分散酶的EDTA液消化传代细胞。同时,观察细胞并绘制细胞生长曲线;采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞角膜蛋白多糖(keratocan)、乙醛脱氢酶(ALDH)、细胞角蛋白12(CK12)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)等基因的表达情况;采用细胞免疫荧光染色以及蛋白质印迹方法检测细胞keratocan蛋白的表达情况。
结果:通过胶原酶消化的方法可以从每只小鼠的角膜基质获取约1×104单个细胞。RT-PCR结果显示:原代细胞表达CSCs标记物keratocan和ALDH,不表达角膜上皮细胞标记物CK12以及角膜内皮细胞标记物NSE;免疫荧光染色和蛋白质印迹结果显示:原代细胞表达keratocan蛋白。因此,本实验获取的原代细胞为CSCs。培养于DMEM基础培养基内的原代CSCs无法增殖。培养于DMEM完全培养基内的CSCs可增殖,但第3代细胞不表达keratocan和ALDH基因以及keratocan蛋白。培养于KSFM培养基内的CSCs也可增殖,第3代细胞仍表达keratocan和ALDH基因以及keratocan蛋白,且与原代细胞相比,表达强度无统计学差异(P>0.05)。
结论:KSFM培养基不仅能维持小鼠CSCs的生物学特性不变,还能有效促进细胞增殖。
参考文献
[1]In vivo confocal microscopy of equine fungal keratitis.Eric C.Ledbetter;Nita L.Irby;Sung G.Kim.Veterinary Ophthalmology,2011
[2]Stromal interleukin-1 expression in the cornea after haze-associated injury.F.L.Barbosa;;S.S.Chaurasia;;H.Kaur;;F.W.de Medeiros;;V.Agrawal;;S.E.Wilson.Experimental Eye Research,2010
[3]The molecular basis of corneal transparency.John R.Hassell;;David E.Birk.Experimental Eye Research,2010
[4]In Vivo Confocal Microscopic Evaluation of Morphologic Changes and Dendritic Cell Distribution in Pterygium.Yan Wang;;Feng Zhao;;Wenqing Zhu;;Jianjiang Xu;;Tianyu Zheng;;Xinghuai Sun.American Journal of Ophthalmology,2010
[5]卢建民.小鼠角膜基质细胞的间充质干细胞样表型和多向分化潜能以及抑制树突状细胞成熟的功能[D].河北医科大学,2011.