背景[1-3]
肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)是一种用于细胞染色的试剂，可以用于显示组织中的肥大细胞。
甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种属于醌亚胺染料类，是碱性染料，甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用，组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色，可染细胞核使之呈蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，可用于尖锐湿疣的初筛及肥大细胞的检测。不推荐用于软骨、胃粘膜等难染组织的染色。
肥大细胞染色
肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)对肥大细胞的染色操作步骤:
（1）组织脱蜡至水。
（2）蒸馏水浸洗2-3次。
（3）甲苯胺蓝染液染20-30min。
（4）稍水洗，洗去多余染色液。
（5）95%酒精分色，在镜下控制分色效果。
（6）用100%酒精脱水。
（7）二甲苯透明，中性树胶封片。
肥大细胞染色结果：肥大细胞颗粒呈红紫色，胞核呈蓝色。
肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)对细胞涂片的染色操作步骤：
（1）细胞涂片后，立即放入95%的乙醇中固定，取出放在纸巾上。
（2）滴加1～2滴稀释后的甲苯胺蓝染色液进行滴染，加盖玻片让染料渗透到细胞中。
（3）后将玻片竖起，稍加压力，使多余染料被纸巾吸去。
（4）无需干燥，直接镜检。
细胞涂片染色结果：细胞核、淋巴细胞呈深蓝色；核仁呈紫红色；红细胞呈橘红；细胞质、单核细胞呈淡蓝色。
肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)在原位杂交中染色操作步骤：
（1）用蒸馏水或去离子水稀释到相应的浓度，凭经验一般稀释比例大于1:10。
（2）玻片在稀释好的染色液中短暂浸泡。
（3）在蒸馏水或去离子水浸泡数次。
（4）按需求进行压片固定。
肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)在神经元细胞的染色操作步骤：
（1）将载有细胞的玻片取出放入4％多聚甲醛中固定1h左右；
（2）到时间后取出用PBS冲洗1～2次即可；
（3）然后加入提前预热的1％甲苯胺蓝溶液，在50度左右的气浴或水浴中染色20～30min；
（4）用梯度酒精已次脱水，分别为75％、90％、100％，也可自定梯度；
（5）在镜下控制分色效果，这一步不太好掌握；
神经元细胞染色结果：可见尼氏小体深蓝色颗粒，细胞核呈淡蓝色，背景基本无色。
应用[4-5]
肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)可以用于大鼠脊髓Fos免疫阳性神经元和外周肥大细胞参与炎性痛觉过敏
部分弗氏佐剂致炎大鼠脊髓背角神经元Fos蛋白的表达目的探讨完全弗氏佐剂(CFA)所致炎性痛大鼠Fos蛋白在脊髓背角痛觉传导通路中的表达及意义。
方法1)16只SD大鼠随机均分为NS和CFA两组(n=8),于大鼠右后肢踝关节外侧皮下分别注射0.9%生理盐水(NS)或完全弗氏佐剂(CFA)50μl,在注射NS或CFA前和注射后1h、4h、12h、1d、3d、7d、14d共8个时刻点用热敏测痛法测定大鼠热缩足反射潜伏期TWL。
2)48只大鼠随机平分为NS和CFA两组后(n=24),分别注射NS或CFA(剂量和注射部位同前),以免疫组化法检测脊髓背角神经元上述8个时刻点Fos蛋白的表达。
结果1)NS组大鼠右足注射NS前后TWL变化不明显(p>0.05);大鼠注射CFA数小时后右足即产生显著的红肿等炎症表现,在4h、12h、1d、3d和7d等5个观察时点,CFA组TWL与NS组相比出现明显降低(p<0.01),12h时为最低点(p<0.01),持续3d后逐渐恢复(p<0.01),14d时基本恢复至基础水平(p>0.05)。
2)NS组脊髓背角Fos免疫阳性神经元(Fos-LIN)基本不表达或散在出现,与基础值相比无明显差异(p>0.05);CFA组中Fos-LIN 1h时最先出现在大鼠右侧脊髓背角I-II层(与NS组比较,p<0.01),4h时V-VI层的Fos-LIN数目逐渐增多(与NS组比较,p<0.01),12h时为脊髓全层Fos-LIN最多出现的时间点,14d时,背角I、II、V、VI层基本未见Fos阳性染色神经元(与NS组比较,p>0.05),同组右侧脊髓III、IV、VII、X层Fos-LIN在1h-14d均比较少见。
结论50μl CFA能诱导大鼠产生为期2周的炎性痛觉过敏。炎症期间脊髓背角神经元Fos蛋白持续表达,且其表达与外周痛觉信号的传导和中枢的调控有关。第二部分炎性痛大鼠模型中外周肥大细胞的表达和作用
研究完全弗氏佐剂(CFA)所致炎性痛大鼠模型中炎症局部肥大细胞(MCs)的表达,探讨肥大细胞在炎性痛中的可能作用机制。
方法SD大鼠54只,随机均分为两组(n=27),于右后肢踝关节外侧皮下分别注射生理盐水(NS)或0.1%CFA 50μl。取大鼠注射药物局部皮肤和皮下组织用肥大细胞染色液(甲苯胺蓝法)染色MCs,并观察注射CFA前(T0)和注射后1h、4h、12h、1d、3d、7d、9d、14d共9个时刻点MCs的数目和形态学变化。
结果1)NS组大鼠右足在1h-14d期间MCs总数和脱颗粒数目无显著差异(p>0.05),高倍光镜下紫红色肥大细胞形状规则,少见脱颗粒细胞;2)与NS组相比,CFA组大鼠MCs总数在1h时明显上升(p<0.01),在7d时最多,14d时仍明显高于NS组同时刻点(p<0.01);脱颗粒MCs数在1h时明显增多(p<0.01),12h时达到高峰,1d后渐降,14d时基本正常(p>0.05),镜下见MCs胞体增大、胞膜破裂、胞浆淡染,细胞多呈不规则状,周围多见紫红色颗粒。结论肥大细胞通过聚集和脱颗粒启动并参与炎性痛的发生和维持。
参考文献
[1]Anti-IgE as a mast cell–stabilizing therapeutic agent.Tse Wen Chang;;Yu-Yu Shiung.The Journal of Allergy and Clinical Immunology,2006
[2]Involvement of protein kinase C in 5-HT-evoked thermal hyperalgesia and spinal fos protein expression in the rat.Xuejiao Chen;;Feihong Bing;;Peifang Dai;;Yanguo Hong.Pharmacology,Biochemistry and Behavior,2006
[3]TGFβ1 induces mast cell apoptosis.Farnaz Norozian;;Mohit Kashyap;;Carlos D.Ramirez;;Neha Patel;;Christopher L.Kepley;;Brian O.Barnstein;;John J.Ryan.Experimental Hematology,2006
[4]TGF-β1 inhibits late-stage mast cell maturation.Mohit Kashyap;;Daniel P.Bailey;;Gregorio Gomez;;Juan Rivera;;Thomas F.Huff;;John J.Ryan.Experimental Hematology,2005
[5]余健.大鼠脊髓Fos免疫阳性神经元和外周肥大细胞参与炎性痛觉过敏[D].苏州大学,2008.