背景[1-3]
枝孢霉通用PCR试剂盒是一种专门用于检测枝孢霉的生物试剂盒，它利用聚合酶链式反应（PCR）技术对样品进行体外扩增，以获得大量的拷贝数。
枝孢霉通用PCR试剂盒通过使用专一性引物和相关无交叉反应的探针，该试剂盒具有高特异性和灵敏度，可以检测出几百拷贝/反应的枝孢霉通用序列。此外，该试剂盒采用一管式荧光定量PCR检测方法，避免了后续污染。
枝孢霉通用PCR试剂盒可用于提供方便快捷的枝孢霉检测方案，且使用该试剂盒时无需提供枝孢霉通用样品以外的其他特殊试剂。
枝孢霉
枝孢霉通用PCR试剂盒实验操作
1.模板制备（样本制备区）
建议使用配套水生动物病害基因组DNA/RNA提取试剂盒系列产品，具体过程详见产品说明书。
2．添加模板（模板添加区，放置于冰盒中进行）
请于-20℃条件下保存，有效期12个月
取出所需测试数的已含有反应液A-TSV-I的PCR管，将试剂完全解冻，离心30秒，在管盖上标记管名（阴性对照管NG、样品XX、阳性对照管PG）。打开管盖向各管管底分别加入0.8μL B-I及0.2μL R-I，盖上阴性对照管管盖，其他各管分别沿管壁加入2μL模板，顺序为待测样品模板、PG-TSV-I，依次盖好各管管盖，离心30秒，立即进行扩增反应。
3.扩增反应（扩增及产物分析区）
①恒温仪器63℃条件下反应60 min。待仪器升温至63℃后，新建程序，设置实验名称及反应时间，将步骤2中离心后的PCR反应管放入恒温荧光分子检测仪，点击开始检测。
②若使用荧光定量PCR仪，则荧光基团选择FAM，淬灭基团选择None，将63℃15 s，63℃45 s作为一个循环，于63℃45 s处收集荧光信号，60个循环。
其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
10.如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复，则反应设置数量相应增加2或3倍。
应用[4-5]
枝孢霉通用PCR试剂盒可以用于发情期大熊猫阴道真菌的分离鉴定及所含酵母菌的药敏分析
为了科学保护大熊猫,提高大熊猫的繁殖率,弄清发情期大熊猫阴道内可培养真菌的种类及对药物的敏感性,为大熊猫的生殖道合理用药提供参考。
方法：通过对成都大熊猫繁育研究基地的10只发情期雌性大熊猫(成绩、北川、蜀兰、庆贺、娅仔、晶晶、大娇、萌萌、娅双、小丫头)阴道分泌物进行真菌分离培养、形态学鉴定；通过真菌ITS序列通用引物ITS1、ITS4对分离真菌使用枝孢霉通用PCR试剂盒扩增、序列测定,再在NCBI BLAST比对其ITS序列基因相似性,提交其序列。并对各真菌进行分析,找出对大熊猫阴道健康或生殖有威胁菌种。选取5种抗真菌药(两性霉素B、制霉菌素、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑)通过丹麦Rosco纸片扩散法对大熊猫发情期阴道分泌物中分离到的5种酵母菌：链状假丝酵母菌(Candida catenulata)、担子菌类酵母菌(Pseudozyma aphidis)、季也蒙毕赤氏酵母菌(Pichia guilliermondii)、汉氏德巴利氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)、皮状丝孢酵母菌(Trichosporon cutaneum)进行药敏试验。
结果：本次试验共分离到30种不同真菌,包含25种霉菌,5种酵母菌。10只大熊猫中有4只(40%)均有青霉属(Penicillium spp.),2(20%)只有曲霉属(Aspergillus spp.),3只(30%)有杂色曲霉(Aspergillus versicolor),3只(30%)有枝孢样枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)。
5种酵母菌均对两性霉素B、制霉菌素敏感；Trichosporon cutaneum对酮康唑、伊曲康唑中度敏感,Debaryomyces hansenii对伊曲康唑中度敏感,Candida catenulata对氟康唑中度敏感,对酮康唑、伊曲康唑耐药。
结论：试验结果表明发情期大熊猫阴道可培养真菌种类主要为霉菌(83.33%),酵母菌较少(16.67%)。Penicillium spp.、Aspergillus spp(特别是Aspergillus versicolor)及Cladosporium cladosporioides可能是熊猫阴道中的定殖菌种；6种霉菌：球毛壳菌(Chaetomium globosum)、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)、互隔交链孢霉(Alternaria alternata)、枝孢样枝孢霉(Cladosporium cladosporioides)、马尔尼菲青霉(Penicilliummarneffe).层生镰刀霉(Fusarium proliferatum)和1种酵母菌：链状假丝酵母菌(C.catenulata)可能对大熊猫健康或繁殖存在威胁。两性霉素B和制霉菌素是临床治疗由本研究中5种酵母菌引起的大熊猫阴道疾病的首选药。
参考文献
[1]Fungal diseases of horses.Claudia Cafarchia;;Luciana A.Figueredo;;Domenico Otranto.Veterinary Microbiology,2013
[2]Phaeohyphomycotic dermatitis in a giant panda(Ailuropoda melanoleuca)caused by Cladosporium cladosporioides.Xiaoping Ma;;Yu Gu;;Xiaomin Liu;;Desheng Li;;Shanshan Ling;;Jiafa Hou;;Chengdong Wang;;Sanjie Cao;;Xiaobo Huang;;Xintian Wen;;Jiaxue Ruan;;Cao Dong;;Changcheng Li;;Yufei Tong.Medical Mycology Case Reports,2013
[3]Retrospective study on equine uterine fungal isolates and antifungal susceptibility patterns(1999–2011).K.A.Beltaire;;S.H.Cheong;;M.A.Coutinho da Silva.Equine Veterinary Journal,2012
[4]Renal fungal bezoar owing to Geotrichum candidum.Peralam Yegneswaran Prakash;;Venkatesh K Seetaramaiah;;Joseph Thomas;;Vinay Khanna;;Sugandhi P Rao.Medical Mycology Case Reports,2012
[5]李长城.发情期大熊猫阴道真菌的分离鉴定及所含酵母菌的药敏分析[D].四川农业大学,2016.