背景[1-3]
A-427人肺腺癌细胞系是一种人肺腺癌细胞系，由Giard·D·J建立，源自一位52岁的肺癌男性白人患者。该细胞系具有贴壁细胞生长特性，细胞形态为上皮细胞样。在培养基方面，A-427细胞系可采用含有10%FBS的MEM培养基，并可添加1%的青霉素/链霉素。在传代过程中，推荐传代比例为1:2-1:4，并每2~3次/周进行换液。
A-427人肺腺癌细胞系
A-427人肺腺癌细胞系操作规程：
一．A-427人肺腺癌细胞系培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640：GIBCO)，90%；优质胎牛血清，10%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。
二．A-427人肺腺癌细胞系细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
A-427人肺腺癌细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。
应用[4-5]
A-427人肺腺癌细胞系可以用于GRK6基因在肺腺癌中的作用及机制研究
明确人肺腺癌中GRK6基因的表达情况及其与临床病理参数之间的关系,阐明GRK6在肺腺癌中表达下调的可能原因以及转录因子C/EBPa对其相关调控机制,探讨C/EBPa/GRK6信号通路在肺腺癌细胞迁移侵袭中的作用。
研究方法:1、用免疫组化法测定包含122例肺腺癌和45例正常肺组织的组织芯片GRK6基因蛋白表达,蛋白免疫印迹检测18例新鲜肺腺癌组织标本和邻近的非癌肺组织标本的蛋白表达,qPCR测定20例新鲜肺腺癌患者癌组织中及匹配的邻近的非癌肺组织标本中GRK6基因的mRNA。统计分析GRK6蛋白表达水平与相关临床病理参数及预后的关系;
2、应用甲基化特异性PCR和亚硫酸氢盐测序PCR检测54例肺腺癌临床标本中GRK6基因启动子区的甲基化状态,分析GRK6基因启动子区的甲基化状态与临床病理参数及预后的关系,并应用亚硫酸氢盐测序PCR检测肺癌细胞系A549、A-427人肺腺癌细胞系、H1299和支气管细胞系16HBE中GRK6基因启动子区的甲基化状态,进一步应用甲基化转移酶抑制剂处理肺癌细胞后观察GRK6基因表达水平的变化;
3、应用生物信息学及染色质免疫共沉淀技术探索并验证可能参与调控GRK6基因表达的转录因子C/EBPa,利用野生型和突变型的GRK6启动子构建重组质粒,并进行荧光素酶报告基因检测以研究C/EBPa与GRK6可能的结合位点对GRK6基因转录的影响。利用染色质免疫共沉淀技术检测肺腺癌组织和邻近的非癌肺组织中C/EBPa和GRK6基因启动子之间的结合情况。对肺癌细胞系A549应用5-氮杂-2’-脱氧胞苷进行去甲基化处理,染色质免疫共沉淀法检测C/EBPa和GRK6基因启动子区结合变化情况;
4、通过沉默及过表达C/EBPa观察GRK6的表达,通过沉默及过表达GRK6观察肺腺癌细胞迁移与侵袭能力的变化,调控肺癌细胞A549及H1299的GRK6表达水平观察EMT相关标记物E-钙黏蛋白和波形蛋白水平的变化,过表达肺癌细胞A549的GRK6水平,观察MMP2、MMP7水平的变化。
研究结果:1、GRK6基因表达水平在肺腺癌组织中显著下调,GRK6阳性染色主要位于肺腺癌细胞的细胞质中。GRK6表达水平与肺腺癌患者的临床分期及肿瘤组织病理分级显著相关,但与性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小、淋巴结状态等临床病理参数无显著相关性;Cox比例风险模型多变量分析显示,GRK6表达(P=0.004)和病理分级(P<0.001)是患者总生存期的独立预后指标。Kaplan-Meier生存分析表明,GRK6的低表达与肺腺癌患者总体生存率差有显著相关性(P<0.001);
2、MSP发显示54例肺腺癌患者中有42例患者的癌组织GRK6启动子区甲基化为高甲基化和部分甲基化,并且甲基化水平与病理分化程度有相关性(P=0.024),但GRK6启动子区甲基化水平与年龄、性别、吸烟情况、淋巴结转移和肿瘤分期无相关性;Kaplan-Meier生存分析显示,在不同甲基化水平的三组患者之间其OS存在差异(P=0.027),但是在无甲基化和部分甲基化组间的OS没有差异(P=0.492);BSP方法检测发现肺腺癌组织和邻近非肿瘤组织GRK6基因启动子区CpG位点的甲基化频率分别为52±7.8%和23±6.5%,肺腺癌组织GRK6基因启动子区甲基化水平明显高于邻近非肿瘤组织;
3、GRK6基因在肺癌细胞系A549和A-427人肺腺癌细胞系中的mRNA水平明显低于支气管细胞系16HBE,GRK6在肺癌细胞系H1299中的mRNA水平与16HBE细胞相比无差异,进一步应用BSP检测上述四种细胞系中GRK6基因启动子区的甲基化水平显示为:A549细胞系中GRK6基因启动子区域的甲基化程度为(63.9%),在A-427人肺腺癌细胞系中为(56.7%),在H1299细胞系中(26.7%)及16HBE细胞系中甲基化程度较低(15.6%);采用5-氮杂-2’-脱氧胞苷对肺癌细胞进行去甲基化处理后,A549和A-427人肺腺癌细胞系细胞中GRK6表达上调；
参考文献
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[2]Chemerin-activated functions of CMKLR1 are regulated by G protein-coupled receptor kinase 6(GRK6)andβ-arrestin 2 in inflammatory macrophages.D.Stephen Serafin;;Brittney Allyn;;Maria F.Sassano;;Roman G.Timoshchenko;;Daniel Mattox;;Jaime M.Brozowski;;David P.Siderovski;;Young K.Truong;;Denise Esserman;;Teresa K.Tarrant;;Matthew J.Billard.Molecular Immunology,2019
[3]The structural basis of the arrestin binding to GPCRs.Vsevolod V.Gurevich;;Eugenia V.Gurevich.Molecular and Cellular Endocrinology,2019
[4]Epigenetic biomarkers of promoter DNA methylation in the new era of cancer treatment.Keishi Yamashita;;Kei Hosoda;;Nobuyuki Nishizawa;;Hiroshi Katoh;;Masahiko Watanabe.Cancer Science,2018
[5]姚苏梅.GRK6基因在肺腺癌中的作用及机制研究[D].苏州大学,2020.