T4多聚核苷酸激酶的应用

2020/1/17 8:12:58

背景及概述[1]

T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase,T4 PNK),是一种多聚核苷酸5' 羟基激酶,可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应:5'-OH+NTP→5'-P+NDP。上述的磷酸化反应是可逆的。当缺失ATP并且存在ADP的情况下,T4多聚核苷酸激酶可以显示出5'磷酸酯酶的活性,催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团向ADP的转移形成ATP。其他NTP也可产生相同的反应:5'-P+NDP→ 5'-OH+NTP(最适pH为6.4左右)。当ATP和ADP都适量存在时,T4多聚核苷酸激酶可以催化单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'磷酸基团和ATP的γ位磷酸基团之间的交换反应。

组分

应用[1]

T4 PNK应用广泛,如寡核苷酸、DNA或RNA的5'末端标记,用作Southern、Northern、 EMSA等的探针,凝胶电泳的marker,DNA测序引物,PCR引物等;使寡核苷酸、DNA或RNA的5'端磷酸化,确保后续连接反应顺利进行;催化3'磷酸化的单核苷酸的5'磷酸化,使该单核苷酸可以和DNA或RNA的3'末端连接;去除3'端磷酸基团。

作为常用的分子生物学试剂,T4 PNK市场需求量巨大,目前基因工程技术克隆的 重组T4多聚核苷酸激酶在pET系统中表达量高,但是存在如下问题:无可溶性标签时易表达 形成包涵体,通过包涵体复性可得到少量的活性蛋白,但是保存过程中蛋白易聚集形成聚体,形成沉淀,稳定性较差;增加可溶性标签可提高可溶性蛋白的比例,但是纯化后的蛋白 活性较低,若去除标签成本较高且得到的活性蛋白稳定性较差。DNA 或 RNA 5´ 末端的磷酸化,以便进行连接反应。DNA 或 RNA 的末端标记,用作探针和进行DNA 测序;将 3´ 端已经磷酸化的单核苷酸 5´ 磷酸化,制备pNp 底物,用于添加到 DNA 或 RNA的 3´ 端;对 3´ 端有磷酸基团的寡核苷酸的 5´ 端进行标记。

活性定义

1 单位指 37℃条件下,30 分钟内催化1nmol 酸不溶性[32P] 掺入所需要的酶量。

使用注意事项[1]

(1)1× T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液:70 mM Tris-HCl pH 7.6,10 mM MgCl2,5 mM DTT,37℃ 温育。

(2)热失活:65℃ 加热 20 分钟。

(3)在放射性标记实验中,可用 1× T4 多聚核苷酸激酶反应缓冲液、50pmol的γ-[32P] ATP和20单位的酶37℃温育30分钟。

(4)T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能发挥活性,但是为了适用于高活力的放射性标记反应,在随酶提供的反应缓冲液中不含ATP。因此在磷酸化修饰核酸时请单独添加终浓度0.5~1mM ATP。

(5)要提高平齐末端或5’凹陷末端的磷酸化效率,可在加入T4多聚核苷酸激酶前,先将DNA溶液于70℃加热5分钟,然后冰上冷却,并加入5%(W/V)的PEG-8000。

(6)一般来说,进行激酶反应之后是连接反应。在这种情况下,T4多聚核苷酸激酶反应在连接酶反应缓冲液中37℃ 温育30分钟即可。反应后的产物可直接进行连接,无需改变缓冲液和进行热失活。如果连接时需要保持其它DNA片段的去磷酸化状态,则需要在连接反应前热失活T4多聚核苷酸激酶。

主要参考文献

[1] CN201611141222.0 T4多聚核苷酸激酶重组酶及其制备方法、表达基因、表达载体以及宿主细胞

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