背景[1-3]
RSC96(大鼠雪旺细胞)是大鼠雪旺细胞（Schwann cells）的一种，被广泛应用于神经科学研究领域。这种细胞系通常是从大鼠的神经组织中提取并培养得到的，具有神经细胞样的生长特性和形态。
RSC96细胞在培养过程中，通常使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培养基，并添加10%胎牛血清（FBS）和1%的抗生素/抗霉菌剂（P/S）来维持细胞的生长和存活。细胞的传代比例通常在1:3至1:4之间，换液频率建议为2~3次/周。
RSC96(大鼠雪旺细胞)
RSC96(大鼠雪旺细胞)培养操作
1)复苏NCI-H647人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)RSC96(大鼠雪旺细胞)传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3)RSC96(大鼠雪旺细胞)冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
RSC96(大鼠雪旺细胞)可以用于葛根素调控Nrf2/SLC7A11/GPX4通路抑制H2O2诱导的RSC96细胞铁死亡
探讨葛根素对H2O2诱导的RSC96细胞铁死亡的保护作用及其机制。
方法:将RSC96(大鼠雪旺细胞)体外培养,随机分成4组:正常组(Control,Con)、模型组(H2O2)、葛根素干预组(H2O2+Pue)和抑制剂组(H2O2+Pue+ML385)。采用如下实验:1.将RSC96(大鼠雪旺细胞)用0～0.75 m M H2O2进行处理,Western blot检测GPX4和PTGS2蛋白表达,以测定H2O2造模浓度及干预时间。
2. 将RSC96(大鼠雪旺细胞)用0.25～1 m M葛根素进行预处理后,加入0.3 m M H2O2干预RSC96细胞24h,CCK-8检测细胞存活率,以确定葛根素干预浓度。
3.Western blot检测各组细胞中SLC7A11、GPX4、Nrf2和HO-1蛋白水平。
4.生化方法检测GSH、MDA、T-SOD、ROS和Fe2+水平。
5.免疫荧光法观察Nrf2蛋白共定位情况。
结果:1.与Con组相比,0.3 m M H2O2处理RSC96(大鼠雪旺细胞)24 h,GPX4的蛋白水平显著下降(P<0.05),PTGS2蛋白表达显著升高(P<0.01),提示RSC96细胞铁死亡模型造模成功。
3. CCK-8结果显示,与Con组相比,H2O2组的细胞存活率显著降低(P<0.01);与H2O2组相比,500μM葛根素预处理RSC96(大鼠雪旺细胞)30 min,细胞存活率显著升高(P<0.01)。
3.WB结果显示,与H2O2组相比,H2O2+Pue组GPX4、SLC7A11、HO-1和Nrf2蛋白表达显著增加(P<0.05或P<0.01)。
4.生化检测结果显示,与Con组相比,H2O2组RSC96细胞GSH和SOD水平显著降低(P<0.05或P<0.01),ROS和MDA水平明显增加(P<0.05或P<0.01);与H2O2组相比,H2O2+Pue组细胞内GSH和SOD水平显著增加(P<0.05或P<0.01),ROS和MDA积累显著下降(P<0.05或P<0.01)。
5.免疫荧光结果显示,与H2O2相比,H2O2+Pue组共定位系数显著增加(P<0.05),而这种作用可被Nrf2蛋白的抑制剂ML385所抑制。
结论:葛根素对H2O2诱导的RSC96(大鼠雪旺细胞)铁死亡具有保护作用,其机制可能是通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路,抑制脂质过氧化实现的。
参考文献
[1]Neuroprotective Mechanisms of Puerarin in Central Nervous System Diseases:Update..Yu ChaoChao;Du YanJun;Li Jin;Li Yi;Wang Li;Kong LiHong;Zhang YingWen.Aging and disease,2022
[2]Puerarin Attenuates Oxidative Stress and Ferroptosis via AMPK/PGC1α/Nrf2 Pathway after Subarachnoid Hemorrhage in Rats.Huang Yi;Wu Honggang;Hu Yongmei;Zhou Chenhui;Wu Jiawei;Wu Yiwen;Wang Haifeng;Lenahan Cameron;Huang Lei;Nie Sheng;Gao Xiang;Sun Jie.Antioxidants,2022
[3]Iron Neurotoxicity and Protection by Deferoxamine in Intracerebral Hemorrhage.Li Zhe;Liu Yang;Wei Ruixue;Khan Suliman;Zhang Ruiyi;Zhang Yan;Yong Voon Wee;Xue Mengzhou.Frontiers in Molecular Neuroscience,2022
[4]UNC5B Overexpression Alleviates Peripheral Neuropathic Pain by Stimulating Netrin-1-Dependent Autophagic Flux in Schwann Cells..Xiao PeiYao;Chen JingYan;Zeng Qing;Huang Zi;Huang BeiXu;Yu Jian;Liao SongJie.Molecular neurobiology,2022
[5]王佳音.葛根素调控Nrf2/SLC7A11/GPX4通路抑制H2O2诱导的RSC96细胞铁死亡[D].湖北民族大学,2023.