背景[1-3]
OVISE人卵巢癌贴壁细胞系是一种用于研究卵巢癌的细胞系。这种细胞系由日本学者于2007年建立，来源于一名53岁的女性卵巢黏液性癌患者的腹水。该细胞系具有高度侵袭性和转移性，可以作为研究卵巢癌发生、发展和转移的模型之一。
OVISE细胞系的建立对于卵巢癌的研究具有重要意义。通过使用这种细胞系，科学家们可以研究卵巢癌细胞的生物学特性、分子机制和药物敏感性等。此外，OVISE细胞系还可以作为筛选和评估卵巢癌治疗药物的模型之一，为卵巢癌的治疗提供重要的参考依据。
OVISE人卵巢癌贴壁细胞系
OVISE人卵巢癌贴壁细胞系培养操作:
1)复苏OVISE人卵巢癌贴壁细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)OVISE人卵巢癌贴壁细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)OVISE人卵巢癌贴壁细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
OVISE人卵巢癌贴壁细胞系可以用于顺铂对巨噬细胞的调控在卵巢癌转移过程中的作用及机制研究
研究方法:(1)分别用PMA和M-CSF刺激THP1细胞和人外周血单核细胞(PBMC),使其诱导成为未活化的巨噬细胞Mφ,通过流式细胞术检测诱导效果;然后用LPS/IFN-γ诱导Mφ成为经典活化的巨噬细胞(CAM),并通过Real-time PCR验证诱导效果。Transwell法检测经化疗药物顺铂、卡铂、环磷酰胺和紫杉醇作用的Mφ和CAM的条件培养基(CM)对卵巢癌细胞A2780和SKOV3侵袭和迁移能力的影响;Western blot检测经顺铂作用的Mφ条件培养基(Cis-Mφ-CM)和CAM条件培养基(Cis-CAM-CM)对A2780细胞的上皮间质转化相关蛋白表达的影响;Real-time PCR检测经顺铂作用后的CAM中极化指标的变化;CCK8法和流式细胞术分别检测Cis-CAM-CM对卵巢癌细胞A2780及SKOV3增殖和凋亡的影响;经Cis-CAM-CM作用后,CCK8法检测卵巢癌细胞对顺铂敏感性的变化。
(2) 通过Luminex液体悬浮芯片检测顺铂处理前后的巨噬细胞CM中的细胞因子的浓度,筛选差异蛋白,并通过Real-time PCR和ELISA分别验证差异基因在m RNA及蛋白水平的表达,确定候选蛋白;用候选蛋白的人源重组蛋白作用于卵巢癌细胞,CCK8法检测候选蛋白对细胞增殖的影响,transwell法检测候选蛋白对细胞迁移的影响;采用候选蛋白的中和抗体阻断Cis-Mφ-CM和Cis-CAM-CM中的候选蛋白,transwell法检测其对卵巢癌细胞侵袭及迁移的影响;采用si RNA敲低A2780和SKOV3中的CCR6表达,Real-time PCR及Western blot验证敲低效果,CCK8法检测Cis-CAM-CM对CCR6-KD卵巢癌细胞增殖的影响,transwell法检测Cis-CAM-CM对CCR6-KD卵巢癌细胞迁移能力的影响,Western blot检测Cis-CAM-CM对CCR6-KD卵巢癌细胞上皮间质转化相关蛋白表达的影响。
(3)Real-time PCR和Western blot检测CCR6在人源永生化卵巢上皮细胞IOSE和卵巢癌细胞株(SKOV3、A2780、HO8910、OVCAR3、OVISE人卵巢癌贴壁细胞系、ES2、HEY)中的表达;CCK8法和Transwell法分别检测rh CCL20对卵巢癌细胞株增殖和迁移的影响;采用si RNA敲低A2780和SKOV3细胞中的CCR6表达,以及Crispr-cas9技术敲除A2780中CCR6的表达,transwell法检测迁移能力的变化,以及rh CCL20对其迁移能力的变化;Western Blot检测A2780和SKOV3细胞经rh CCL20作用后MAPK信号和Akt信号通路的激活情况;构建裸鼠腹腔移植瘤模型,检测CCL20-CCR6轴在体内卵巢癌转移过程中的作用;采用KM plotter分析卵巢癌组织中CCR6表达与卵巢癌病人预后的相关性,采用基因富集分析探讨卵巢癌组织中CCR6表达与转移相关基因集表达的相关性。
参考文献
[1]SIRT1 inhibits hepatocellular carcinoma metastasis by promoting M1 macrophage polarization via NF-κB pathway..Zhou Bei;;Yang Yun;;Li Cuiping.OncoTargets and therapy,2019
[2]Macrophage Polarization:Different Gene Signatures in M1(LPS+)vs.Classically and M2(LPS–)vs.Alternatively Activated Macrophages.Marco Orecchioni;;Yanal Ghosheh;;Akula Bala Pramod;;Klaus Ley;;Klaus Ley.Frontiers in Immunology,2019
[3]Chemokines Modulate Immune Surveillance in Tumorigenesis,Metastasis,and Response to Immunotherapy..Vilgelm Anna E;;Richmond Ann.Frontiers in immunology,2019
[4]Stromal Cell-Derived CCL20 Promotes Tumor Progression and Osteolysis in Giant Cell Tumor of Bone.Chenglong Zhao;;Dongsheng Wang;;Liang Tang;;Zhichao Zhang;;Song Li;;Ming Qian;;Zhipeng Wu;;Wang Zhou;;Mingyao Liu;;Jian Luo;;Tielong Liu;;Zhenxi Li;;Jianru Xiao.Cellular Physiology and Biochemistry,2018
[5]刘婉.顺铂对巨噬细胞的调控在卵巢癌转移过程中的作用及机制研究[D].上海交通大学,2022.