背景[1-3]
OE19人食管癌细胞系是一种来源于人类食管鳞状细胞癌的细胞系。OE19人食管癌细胞系是于1993年从一名72岁男性患者的贲门/食管胃交界处的腺癌中建立。肿瘤被确定为病理分期III(UICC)并显示出中度分化。细胞系OE19组成型表达HLA-A、-B和-C抗原(MHC I类)。用干扰素-γ处理诱导ICAM-1(CD54)的表达。仅在OE19亚群中测量了添加干扰素-γ时HLA-DR(MHC II类)的表达。这些细胞表达上皮细胞角蛋白，并且在裸鼠中具有致瘤性。在ECACC测试时，通过短串联重复序列(STR)-PCR分析无法在该细胞系中检测到Y染色体。众所周知，由于癌细胞系的遗传不稳定性增加，Y染色体可能会重新排列或丢失，从而导致检测不到。
OE19人食管癌细胞系
一．OE19人食管癌细胞系培养基及培养冻存条件准备：
1）准备1640（推荐YJ-0002）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
二．OE19人食管癌细胞系细胞处理：
1）冻存细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）OE19人食管癌细胞系细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×106~1×107个活细胞/ml.
2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×106~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
应用[4-5]
OE19人食管癌细胞系可以用于Gli对食管腺癌OE19细胞生物学作用的体外实验研究
通过siRNA抑制Gli在食管腺癌OE19人食管癌细胞系细胞中的表达,探讨了Gli表达下调对食管腺癌细胞生长和侵袭能力的影响及可能的分子机制,旨在为临床上食管腺癌的靶向治疗提供新思路。
方法:将不同浓度(50nmol/L和100nmol/L)Gli1、Gli2siRNA和空白对照siRNA转染食管腺癌OE19人食管癌细胞系细胞48h,实时荧光定量PCR法检测食管腺癌OE19细胞Gli1和Gli2mRNA表达水平;免疫印迹试验检测siRNA转染OE19细胞后Gli1、Gli2、Cyclin D1、Snail和E-cadherin蛋白表达水平;流式细胞术检测OE19细胞增殖和细胞周期分布;Transwell侵袭实验观察siRNA抑制Gli表达后对食管腺癌细胞侵袭转移能力的影响。
结果:1.OE19人食管癌细胞系细胞Gli1mRNA和Gli2mRNA的表达将Gli1和Gli2siRNA组检测数据与control组(空白对照siRNA)相比较,Gli1siRNA中siRNA1mRNA和siRNA2mRNA较control组均显著降低,三组方差分析,差异比较有统计学意义(F=113.134,P=0.000),siRNA1mRNA与control比较,差异有统计学意义(P=0.000),siRNA2mRna与control比较,差异有统计学意义(p=0.000),sirna1mrna与sirna2mrna比较,差异有统计学意义(p=0.033);gli2sirna中sirna1mrna和sirna2mrna较control组均显著降低,三组方差分析,差异比较有统计学意义(f=262.329,p=0.000),sirna1mrna与control比较,差异有统计学意义(p=0.000),sirna2mrna与control比较,差异有统计学意义(p=0.000),sirna1mrna与sirna2mrna比较,差异有统计学意义(p=0.021)。
2. OE19人食管癌细胞系细胞中蛋白表达westernblot结果表明:gli1蛋白表达各组间有显著性差异(f=1583.808,p=0.000);gli2蛋白表达各组间有显著性差异(f=529.058,p=0.000);snail蛋白表达各组间有显著性差异(f=1201.971,p=0.000);e-cadherin蛋白表达各组间有显著性差异(f=1742.273,p=0.000)cyclind1蛋白表达各组间有显著性差异(f=677.638,p=0.000);其中经sirna1处理细胞后gli1(p=0.000)、gli2(p=0.000)、snail(p=0.000)和cyclind1(p=0.000)蛋白表达均显著低于control组,e-cadherin(p=0.000)蛋白表达高于control组,差异均有统计学意义;与control组相比sirna2处理组gli1(p=0.000)、gli2(p=0.000)、snail(p=0.000)和cyclind1(p=0.000)蛋白表达均显著降低,e-cadherin(p=0.000)蛋白表达增高,差异均有统计学意义。经sirna2处理细胞后gli1(p=0.000)、gli2(p=0.000)、snail(p=0.000)和cyclind1(p=0.000)蛋白表达均低于sirna1组,e-cadherin(p=0.000)蛋白表达高于sirna1组,差异均有统计学意义;
3细胞周期研究结果g0/g1期control组细胞为(42.62±2.25)%,sirna1组细胞为(58.68±2.43)%、sirna2组细胞为(67.39±3.21)%,三组比较方差分析结果(f=66.804,p=0.000),sirna1组显著高于control组,差异比较有统计学意义(p=0.000),sirna2组高于control组,差异比较有统计学意义(p=0.000),sirna2组显著高于sirna1组(p=0.000);s期control组细胞为(45.38±2.02)%,sirna1组细胞为(39.51±2.72)%、sirna2组细胞为(28.45±2.04)%,三组比较方差分析结果(f=42.525,p=0.000),sirna1组低于control组(p=0.032),sirna2组低于control组(P=0.000),SiRNA2组显著低于SiRNA1组(P=0.000),差异比较有统计学意义。G2/M期Control组细胞为(6.00±1.96)%,siRNA1组细胞为(5.81±2.01)%、SiRNA2组细胞为(5.16±2.34)%,三组比较方差分析结果(F=0.131,P=0.879),差异比较无统计学意义。
参考文献
[1]Non-canonical GLI1/2 activation by PI3K/AKT signaling in renal cell carcinoma:A novel potential therapeutic target.Jiancheng Zhou;;Guodong Zhu;;Jun Huang;;Lei Li;;Yuefeng Du;;Yang Gao;;Dapeng Wu;;Xinyang Wang;;Jer-Tsong Hsieh;;Dalin He;;Kaijie Wu.Cancer Letters,2016
[2]Sonic hedgehog signaling in hepatocellular carcinoma:A pilot study.Mohannad Dugum;;Ibrahim Hanouneh;;Thomas Mcintyre;;Rish Pai;;Federico Aucejo;;Bijan Eghtesad;;Nizar Zein.Molecular and Clinical Oncology,2016
[3]Targeting of sonic hedgehog‑Gli signaling:A potential therapeutic targetfor patients with breast cancer.Lingqin Song;;Weifeng Wang;;Di Liu;;Yang Zhao;;Jianjun He;;Xijing Wang;;Zhijun Dai;;Huimin Zhang;;Xiao Li.Oncology Letters,2016
[4]Tetrandrine reverses epithelial-mesenchymal transition in bladder cancerby downregulating Gli-1.Yongjian Zhang;;Wei Liu;;Wenbo He;;Yuanyuan Zhang;;Xiuling Deng;;Yanmin Ma;;Jin Zeng;;Bo Kou.International Journal of Oncology,2016
[5]高明敏.Gli对食管腺癌OE19细胞生物学作用的体外实验研究[D].河北医科大学,2018.