背景[1-3]
仓鼠肾成纤维细胞是一种来源于仓鼠肾脏的成纤维细胞系。这些细胞具有较强的增殖能力和良好的细胞形态，广泛应用于生物学和医学研究中。
仓鼠肾成纤维细胞可以用于研究肾脏疾病的发生机制、药物筛选和毒性评价等。例如，可以通过细胞培养技术，观察不同药物对细胞增殖、凋亡、代谢等方面的影响，从而评估药物的疗效和安全性。
此外，仓鼠肾成纤维细胞还可以用于研究肾脏疾病的分子机制和信号通路。通过基因表达分析、蛋白质组学研究等技术手段，可以深入了解肾脏疾病的发生和发展过程，为疾病的诊断和治疗提供重要的理论基础。
仓鼠肾成纤维细胞
仓鼠肾成纤维细胞培养操作
1)复苏仓鼠肾成纤维细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)仓鼠肾成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)仓鼠肾成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
仓鼠肾成纤维细胞可以用于鸭坦布苏病毒诱导细胞自噬的机制研究
细胞自噬是一种在真核生物中高度保守的细胞内分解代谢途径,可去除衰老、聚集、未折叠的蛋白质和受损的细胞器。同时,大量研究证实,细胞自噬在病毒感染中也发挥重要作用,可以调控病毒的复制和宿主免疫反应,从而影响病毒的致病性。除了DTMUV外,黄病毒属还包括多种人畜共患病病毒,例如西尼罗河病毒(West Nile virus,WNV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)等。报道表明,细胞自噬在多种黄病毒的感染和复制中起着重要作用,但DTMUV与细胞自噬之间的具体相互作用尚不清楚。因此,本研究分析了DTMUV与自噬间的相互关系、DTMUV的编码蛋白对自噬的影响,以及DTMUV及其重要功能蛋白诱导自噬的相关信号通路。
研究结果表明,DTMUV感染鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblasts,DEF)和仓鼠肾成纤维细胞后能显著诱导LC3-II的表达,引起细胞自噬,使用自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)和自噬抑制剂3-MA(3-Methyladenine)分别处理细胞后感染DTMUV,发现诱导自噬能促进病毒复制,而抑制自噬则显著降低了病毒的复制。为确定DTMUV诱导自噬的主要功能蛋白,将DTMUV的3种结构蛋白(衣壳蛋白C、膜蛋白M、囊膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)转染DEF细胞。
结果表明,DTMUV非结构蛋白NS3能诱导细胞自噬,又通过Western blot、免疫荧光和透射电镜观察等方法,验证了NS3蛋白对自噬的诱导且发现其能诱导完整的自噬流。
此外,为进一步明确NS3蛋白诱导细胞自噬的信号通路,使用细胞外信号调节激酶2(Extracellular regulated protein kinases 2,ERK2)的特异性抑制剂U0126和si RNA抑制ERK2介导的信号通路后,发现NS3蛋白诱导的自噬水平降低,说明ERK2参与NS3蛋白诱导的细胞自噬。最后,通过抑制NS3诱导的自噬,与对照组相比DTMUV复制和滴度降低,说明NS3诱导的自噬同样可以促进DTMUV的复制。
综上所述,DTMUV感染DEF细胞可诱导细胞自噬,且NS3蛋白能通过ERK2信号通路诱导自噬,诱导的自噬能促进病毒复制。以上研究结果为进一步研究DTMUV与自噬的相互关系奠定了基础,同时也加深了对DTMUV分子致病机制的理解。
参考文献
[1]Role of apoptosis in Duck Tembusu virus infection of duckling brains in vivo.Yang Sheng;Wu Jingxian;Huang Yufei;Zhang Yafei;Shi Yonghong;Yang Ping;Chen Qiusheng.Poultry Science,2022
[2]Autophagy inhibitors alleviate Japanese encephalitis virus-induced cerebral inflammation in mice..Zhang Jinhua;Han Wei;Xie Changqing;Gao Mingxing;Wang Xugang;Hu Xueying;Zhang Wanpo;Cao Shengbo;Liu Xiaoli;Cheng Guofu;Gu Changqin.Archives of virology,2022
[3]Effects of Aedes aegypti salivary protein on duck Tembusu virus replication and transmission in salivary glands..SriIn Chalida;Thontiravong Aunyaratana;Bartholomay Lyric C;Tiawsirisup Sonthaya.Acta tropica,2022
[4]Identification and antiviral effect of Cherry Valley duck IRF4.Zhai Xinyu;Hong Tianqi;Zhang Tingting;Xing Bin;Wang Jinchao;Wang Xiuyuan;Miao Runchun;Li Tianxu;Wei Liangmeng.Poultry Science,2022
[5]赵君.鸭坦布苏病毒诱导细胞自噬的机制研究[D].山东农业大学,2023.