背景[1-3]
SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(5×)是一种用于SDS-PAGE电泳的加样缓冲液，主要成分包括甘油、Tris-HCl、溴酚蓝、甘油、β巯基乙醇、辛酸钠、SDS等。该缓冲液主要应用在蛋白质样品的保存和上样，通过调整PH值和还原剂的浓度，该缓冲液可以用于常规的还原性SDS-PAGE蛋白样品的上样。
SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(5×)
SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(5×)以下是其主要成分和作用：
1.Sodium dodecyl sulfate(十二烷基硫酸钠):是一种强碱性阴离子表面活性剂，可以破坏蛋白质的氢键和疏水作用，使蛋白质在电泳过程中更容易分离。
2.Tris(三羟甲基氨基甲烷):是一种缓冲剂，可以调节溶液的pH值，使蛋白质在电泳过程中保持稳定。
3.Glycerol(甘油):是一种溶剂，可以增加溶液的黏度，使蛋白质在电泳过程中更容易聚集。
4.Bromophenol blue(溴酚蓝):是一种染料，可以指示蛋白质的迁移位置。
5.SDS(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳):是一种电泳技术，可以将蛋白质分离成不同的带状图案。
在使用SDS-PAGE蛋白加样缓冲液时，需要注意以下几点：
1.严格按照说明书的配方和比例配制缓冲液。
2.在加入蛋白质前，需要将缓冲液加热至95°C，并保持5分钟，以使蛋白质变性。
3.在加入蛋白质后，需要迅速冷却至室温，以避免蛋白质再次变性。
4.在进行电泳前，需要将凝胶固定在玻璃板或塑料板上，并加入适量的电泳缓冲液。
应用[4-5]
SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(5×)可以用于僵蚕产地相关蛋白质分子标记的挖掘与研究
探究僵蚕蛋白质的优化提取工艺,并以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及改进的丙酮分级沉淀(AFP)/Tricine-SDS-PAGE技术研究僵蚕蛋白质组成,分析其差异表达蛋白质分子,为挖掘僵蚕产地溯源相关蛋白质分子标记及进一步阐明环境因子对各产地僵蚕品质形成的影响提供理论依据。
主要研究结果如下:1、建立了僵蚕醇溶蛋白质的优化提取工艺,并建立相应的SDS-PAGE、HPLC、FTIR指纹图谱。结果表明:僵蚕醇溶蛋白质的最佳提取工艺条件为料液比1:24.22g·mL-1,乙醇浓度38.73%,温度35℃,提取时间3.94 h,此时提取率为0.5402%。加入SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(5×)后SDS-PAGE结果表明僵蚕醇溶蛋白质分子量集中在16.7～36.2 kDa;HPLC结果表明主要僵蚕醇溶蛋白质的保留时间为2.048 min与3.354 min,其含量分别占总蛋白量的31.23%与32.93%;FTIR结果表明僵蚕醇溶蛋白质在2927.71、1631.71、1457.24、1310.71 cm-1处有主要吸收峰。
2、建立了可用于僵蚕药材鉴定的优化的蛋白质SDS-PAGE指纹图谱。采用0.1 M HAc-NaAc缓冲液(pH 4.3)、0.1 M Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)、ddH2O和40%乙醇提取滇产、川产僵蚕蛋白质,加入SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(5×)并进行SDS-PAGE分析,结果表明,当蛋白质加样量为20μg,凝胶浓度为14%时,僵蚕蛋白质指纹图谱达到最佳分辨率。硝酸银染色法较考马斯亮蓝法灵敏度更高,而Tricine-SDS-PAGE更适用于分析僵蚕中的小分子蛋白质。
3、挖掘滇产、川产僵蚕中差异表达蛋白质分子,并对其进行LC-MS/MS鉴定及生物信息学分析。以0.1 M HAc-NaAc缓冲液(pH 4.3)、0.1 M Tris-HCl缓冲液(pH 8.6)、ddH2O和40%乙醇分别提取滇产及川产僵蚕蛋白质,加入SDS-PAGE蛋白加样缓冲液(5×)并进行改进的AFP/Tricine-SDS-PAGE分析,凝胶对比共发现16条多态性条带,LC-MS/MS鉴定共计获得273个得分值≥1.3的差异表达分子。
4、同时对差异表达分子进行生物信息学分析,结果表明这些差异表达分子主要分布在细胞有机体、细胞核以及细胞质中,其分子功能分类主要包括催化活性以及结合功能,其生物学过程主要集中在细胞进程、代谢进程、应激反应、生物调节等,其中糖类代谢运输相关蛋白质含量占比最高,达到25.78%,蛋白质转化、修饰相关蛋白质及分子伴侣蛋白含量占比次之,达到23.83%,并且这些差异分子主要涉及了次生代谢产物的生物合成信号通路、微生物代谢信号通路、抗生素的生物合成信号通路、碳代谢信号通路、氨基酸生物合成信号通路等。
参考文献
[1]LC/MS/MS-based quantitation of pig and human S100A1 protein in cardiac tissues:Application to gene therapy.Bogdan G.Sleczka;;Paul C.Levesque;;Leonard P.Adam;;Timothy V.Olah;;Petia Shipkova.Analytical Biochemistry,2020
[2]Analysis of silver-associated proteins in pathogen via combination of native SDS-PAGE,fluorescent staining,and inductively coupled plasma mass spectrometry.Yiling Li;;Mengni Zhang;;Chengbin Zheng;;Ligang Hu;;Chao Wang;;Jie Jiang;;Bin He;;Guibin Jiang.Journal of Chromatography A,2019
[3]Dueling electrospray implemented on a traveling-wave ion mobility/time-of-flight mass spectrometer:Towards a gas-phase workbench for structural biology.Ian K.Webb;;Lindsay J.Morrison;;Jeffery Brown.International Journal of Mass Spectrometry,2019
[4]Application of two-dimensional gel electrophoresis technique for protein profiling of Indian black gram varieties and detection of adulteration in black gram-based food products using comparative proteomics..Amane Dhanashree;;Ananthanarayan Laxmi.Food chemistry:X,2019
[5]王立勇.僵蚕产地相关蛋白质分子标记的挖掘与研究[D].江苏大学,2022.