背景[1-3]
多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒采用PCR技术，针对多食棘阿米巴属通用的基因高度保守区域设计特异性引物，用PCR技术对多食棘阿米巴属通用的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含多食棘阿米巴属通用核酸模板的情况下，PCR反应进行特异性扩增，利用琼脂糖凝胶电泳技术对PCR扩增产物进行检测，依据特异性扩增片段的结果，判断待检样品中是否含有多食棘阿米巴属成分，实现检测结果的定性分析。
多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒
多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒包含以下主要成分：
1.多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒PCR反应液：包含引物、dNTPs、缓冲液等成分，用于扩增目标DNA序列。
2.多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒DNA提取液：用于提取样本中的DNA。
3.多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒酶标板：用于承载PCR反应液和DNA提取液。
4.多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒标准品：用于定量测定PCR反应液中扩增产物的数量。
多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒具有以下特点：
灵敏度高：能够检测到非常低浓度的多食棘阿米巴属DNA。
特异性强：能够准确区分多食棘阿米巴属和其他常见病原体。
操作简便：只需要将样本加入到多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒酶标板中，加入PCR反应液和DNA提取液，经过一定时间的反应后即可得到结果。
多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒广泛应用于医学、食品安全等领域，可以用于检测食品、水体、土壤等样本中是否存在多食棘阿米巴属的污染。
应用[4-5]
多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒可以用于角膜炎棘阿米巴培养及18SrDNA基因分型
目的:建立经济、有效的角膜炎棘阿米巴(Acanthamoeba)培养、分离方法,并鉴定其基因型;探讨相关技术在棘阿米巴角膜炎早期诊断中的可行性及优越性。
方法:取16例门诊拟诊为棘阿米巴角膜炎患者的角膜材料或角膜刮取物置于平铺了一层活的大肠杆菌的NNA平板上,28℃恒温培养14天,在倒置显微镜下取远离接种中心的单个胞囊接种在另一NNA内28℃培养,连续观察棘阿米巴生长繁殖过程。对从AK患者病灶取下的角膜组织,一部分直接利用DNA抽提试剂盒提取棘阿米巴基因组DNA。在多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒扩增体系中加入棘阿米巴特异性引物JDP1-JDP2,扩增部分18SrDNA片段,琼脂糖凝胶电泳观察。另一部分以10%KOH湿封片镜检,对比参照。冲洗培养基表面中的棘阿米巴,提取DNA、扩增序列后利用892C引物测序。再利用Clusta X软件进行序列匹配,MEGA2建立进化树,完成部分棘阿米巴基因分型。
结果:1、棘阿米巴培养:在28℃恒温箱铺有活大肠杆菌的NNA培养基上培养3天左右,有棘阿米巴生长。以接种点为中心呈放射状。14例(78%)角膜炎患者培养阳性。
2、多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒结果:对从棘阿米巴角膜炎患者病灶取下的角膜组织,直接进行PCR扩增16个病例(18只眼),其中12例(67%)可观察到棘阿米巴特异性条带。片段大约在450bp左右。证实棘阿米巴原虫感染。
3、角膜刮片镜检:10%KOH角膜刮片后镜检16例病例,有5例发现了棘阿米巴包囊。与PCR技术诊断方法比较,两种诊断方法用Fisher确切概率法统计,P<0.05;联合PCR技术和刮片镜检方法可提高棘阿米巴性角膜炎诊断率83.3%
4、18S rDNA基因测序分型结果:对14株角膜刮除物标本培养阳性的棘阿米巴虫株PCR扩增,并测序后共得到14个分型序列3(DF3序列)。在14个序列中,共有8个基因序列互不相同,全部与已经鉴定的Rns T4基因型序列相似。
结论:建立了分离及培养棘阿米巴的实验方法;所有分离自角膜炎患者的棘阿米巴虫株均属Rns T4基因型,且50%来自水域污染;18SrDNA的多食棘阿米巴属通用PCR试剂盒扩增技术对早期诊断棘阿米巴角膜炎及明确其分型有重要的临床应用价值。
参考文献
[1]In Vivo and Ex Vivo Laser Confocal Microscopy Findings in Patients With Early-stage Acanthamoeba Keratitis.Akira Kobayashi;;Yasuhisa Ishibashi;;Yosaburo Oikawa;;Hideaki Yokogawa;;Kazuhisa Sugiyama.Cornea,2008
[2]Clinical and experimental findings in Acanthamoeba keratitis with Heidelberg Retina Tomograph III‐RCM.ZhangChen;DengShijing;WangZhiqun;LiRan;SunXuguang.Ophthalmic and Physiological Optics,2008
[3]Heidelberg Retina Tomograph II Findings of Acanthamoeba Keratitis.Tristan Bourcier;;Bénédicte Dupas;;Vincent Borderie;;Christine Chaumeil;;Pierre Larricart;;Christophe Baudouin;;Laurent Laroche.Ocular Immunology and Inflammation,2005
[4]Heidelberg Retina Tomograph II Findings of Acanthamoeba Keratitis.Tristan Bourcier;;Bénédicte Dupas;;Vincent Borderie;;Christine Chaumeil;;Pierre Larricart;;Christophe Baudouin;;Laurent Laroche.Ocular Immunology and Inflammation,2005
[5]刘晓燕.角膜炎棘阿米巴培养及18SrDNA基因分型[D].福建医科大学,2009.