背景[1-3]
双缩脲总蛋白试剂是一种用于测定蛋白质浓度的试剂。双缩脲试剂的原理是双缩脲反应，也称为酰化反应，是由双缩脲试剂和蛋白质中的肽键发生反应，形成一种紫色的络合物。蛋白质中的肽键在碱性介质中与铜离子反应，生成紫色的络合物，这种反应称为双缩脲反应。双缩脲试剂中包含的碱性物质如氢氧化钠，可以提供反应所需的碱性环境，而硫酸铜则提供铜离子参与反应。当蛋白质存在时，其肽键与铜离子发生反应，生成紫色的络合物，这种络合物可以根据其吸光度来测定蛋白质的含量。因此，双缩脲试剂常用于测定生物样品中的总蛋白质含量。
双缩脲总蛋白试剂具有以下特点：
高灵敏度：该试剂对蛋白质具有较高的灵敏度，可以检测到低浓度的蛋白质。
操作简便：双缩脲总蛋白试剂的操作步骤简单，不需要复杂的仪器设备。
广泛适用性：双缩脲总蛋白试剂适用于各种类型的蛋白质样品，包括血清、血浆、细胞培养液等。
稳定可靠：该试剂具有良好的稳定性和可靠性，可以在一定时间内保持其测定结果的准确性。
双缩脲总蛋白试剂在生物学、医学等领域具有广泛的应用，如蛋白质定量分析、药物研发、疾病诊断等。通过使用双缩脲总蛋白试剂，可以快速、准确地测定蛋白质浓度，为相关研究提供有力支持。
双缩脲总蛋白试剂反应结果
双缩脲总蛋白试剂操作步骤如下：
1.准备双缩脲试剂。将硫酸铜、酒石酸钾钠溶于水，并加入氢氧化钠溶液，用水稀释至1升，储存在塑料瓶中。
2.将待测样品加入试管中，加入双缩脲试剂，摇匀。
3.在室温下放置30分钟，让试剂与蛋白质充分反应。
4.在540nm波长处测量吸光度。
5.根据测量结果绘制标准曲线，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标。
6.根据标准曲线，确定待测样品的蛋白质浓度。
应用[4-5]
双缩脲总蛋白试剂可以用于花生蛋白肽的检测及抗氧化活性研究
花生肽属于花生蛋白的精深加工产品,经分解得到,属于小分子的氨基酸聚合物,是一种功能性物质。
本文主要研究氨基酸分析仪测定法、双缩脲总蛋白试剂双缩脲法、凯氏定氮法和紫外分光光度法在花生肽含量测定中的应用,并通过对纯化花生肽的分析,了解其特性,制备抗氧化性花生肽。
(1)蛋白质沉淀剂的筛选及应用条件八种试剂三氯乙酸、草酸、磺基水杨酸、硫酸、盐酸、磷酸、乙醇和丙酮的沉淀效果经比较发现,采用双缩脲方法时,三氯乙酸为最佳沉淀剂；采用凯氏定氮法测定时,三氯乙酸、草酸、磷酸和乙醇可作为沉淀剂。三氯乙酸为最佳沉淀剂,两种方法皆可选用。用最佳沉淀剂三氯乙酸沉淀样品中的蛋白质,其浓度可在0.66-1.32mol/L范围内选择。当0.66rmo1/L三氯乙酸与样品1：1混匀反应,40min内,离心过滤,4h内完成测定。当1.32mol/L三氯乙酸与样品1：1混匀反应,沉淀30min后离心过滤,2h内完成测定。清液可在低温下进行短期的保藏。
(2)酸溶花生肽含量的测定经氨基酸分析仪测定酸溶花生肽的游离氨基酸和水解氨基酸的含量,算得酸溶花生肽的含量为0.49g/100g。双缩脲总蛋白试剂的测定条件：保持清液温度与环境温度一致；TCA浓度为1.32mol/L时,至少需反应20min;低于该浓度,至少需反应30min；保持反应体系pH稳定,清液与双缩脲试剂的最佳体积比为1：3。双缩脲法测得酸溶花生肽的含量为0.69g/100g。与氨基酸分析仪测定的含量值相比,该法的测定结果偏大。根据酸溶花生肽转化系数的五种计算方式,算得KA、KA’、KP、K、K’值,分别为4.90、4.70、3.55、4.22、4.13,相应的酸溶花生肽含量分别为0.57g/100g、0.54g/100g、0.38g/100g、0.47g/100g、0.46g/100g。比较发现,K值计算得到的肽含量值0.47g/100g最接近氨基酸分析仪测得的含量值0.49g/100g。故花生肽的转化系数为4.22,远低于花生蛋白的转化系数5.46。
(3)花生肽的纯化工艺按原产品工艺制备花生蛋白酶解物,将其进行脱脂和大孔树脂纯化实验。脱脂工艺：每5.00g花生肽60℃干燥3h,加入30.00mL正己烷,在70℃下,脱脂6h。大孔树脂纯化工艺：用DA201-C型大孔树脂填充柱子,将50.00mL30.00mg/mL的脱脂花生蛋白酶解物以0.5mL/min的速度上样,并用75%的乙醇以2.0mL/min的速度洗脱柱子,收集278nm波长下的纯化副产品PP1,和250nm紫外波长下的花生肽PP2。
(4)纯化花生肽含量的测定10.00mg/mL PP1和PP2,经紫外分光光度法和荧光探针法测定,两者的含量值与疏水值分别为(9.47±0.086mg/mL,1328.70)、(28.13±0.13mg/mL,8146.00)。由此表明,疏水性大的,紫外测定结果偏大。双缩脲总蛋白试剂测定时发现,10.00mg/mL PP1和PP2含量分别为1.40±0.065mg/mL.0.68±0.052mg/mL。测定结果远小于紫外测定结果。
参考文献
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[3]Improvement of functional properties of peanut protein isolate by conjugation with dextran through Maillard reaction.Yan Liu;;Guanli Zhao;;Mouming Zhao;;Jiaoyan Ren;;Bao Yang.Food Chemistry,2011
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[5]刘聃.花生蛋白肽的检测及抗氧化活性研究[D].西南大学,2013.