背景[1-3]
A375人恶性黑色素瘤细胞是一种常用的研究恶性黑色素瘤的细胞系。它是由美国国立癌症研究所(NCI)创建的一个细胞系，主要用于研究恶性黑色素瘤的生物学特性、药物敏感性以及可能的治疗方法。A375人恶性黑色素瘤细胞是从一名患有黑色素瘤的54岁女性患者的皮肤中分离出的一种细胞系。细胞携带BRAFV600E突变，并对MEK抑制高度敏感。有研究报道：使用维莫非尼(Vemurafenib)处理A375人恶性黑色素瘤细胞，增强了干扰素γ和IFNα2b对MHC I类和II类分子的诱导作用
A375人恶性黑色素瘤细胞具有以下特点：
形态特征：人恶性黑色素瘤细胞呈多角形或长条形，有多个突起，核较大，核质比高。
生长特性：人恶性黑色素瘤细胞生长迅速，分裂能力强，可以在体外持续传代。
黑色素生成能力：人恶性黑色素瘤细胞具有黑色素生成能力，因此常用于研究黑色素瘤的发生、发展和治疗。
药物敏感性：人恶性黑色素瘤细胞对多种抗癌药物具有敏感性，因此常被用于药物筛选和药效评价。
基因表达特征：人恶性黑色素瘤细胞具有一些与恶性黑色素瘤相关的基因表达特征，如BRAF、NRAS等突变基因的高表达。
通过研究A375人恶性黑色素瘤细胞，可以深入了解恶性黑色素瘤的生物学特性，为临床治疗提供理论依据和实验基础。
A375人恶性黑色素瘤细胞
A375人恶性黑色素瘤细胞培养操作
1)复苏A375人恶性黑色素瘤细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)A375人恶性黑色素瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)A375人恶性黑色素瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
A375人恶性黑色素瘤细胞可以用于五种中药单体对人恶性黑色素瘤细胞A375的体外增殖及酪氨酸酶活性作用的研究
姜黄挥发油对多种肿瘤细胞具有抑制作用,能显著减少肿瘤数目,缩小瘤体体积,其主要作用于肿瘤早期,还能预防肿瘤形成。
研究姜黄挥发油(turmeric volatile oil,TVO)对A375人恶性黑色素瘤细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其作用机制。
方法：不同浓度TVO在体外对A375人恶性黑色素瘤细胞的作用。细胞增殖-毒性检测(CCK8)法测不同浓度TVO(0160mg/L)在不同时间段(24h、48h、72h)对A375人恶性黑色素瘤细胞的增殖抑制率;根据CCK8结果选取有效最低药物浓度进行实验:吉姆萨染色,倒置显微镜观察细胞凋亡形态;DNA片段化检测细胞凋亡;流式细胞术测细胞凋亡率;Western blot检测Caspase-3及BIRC7蛋白表达。
结果：随TVO浓度的增加对A375人恶性黑色素瘤细胞生长具有显著的抑制增殖作用,CCK-8结果示浓度为(0、2.5、5、10、20、40、80、160mg/L)TVO,24h抑制率分别为(0、2.5、5、10、20、40、80、160mg/L)TVO,24h抑制率分别为(0.00±0.00、0.015±0.02、0.084±0.02、0.087±0.01、0.096±0、0.087±0.01、0.122±0.03、0.209±0.01);48h(0.00±0.00、0.005±0.00、0.139±0.02、0.160±0.01、0.217±0.03、0.225±0.02、0.246±0.01、0.355±0.01);72h(0.00±0.00、0.323±0.00、0.446±0.01、0.470±0.02、0.479±0.02、0.352±0.01、0.385±0.02、0.441±0.01),与0mg/L相比P<0.05;TVO诱导A375人恶性黑色素瘤细胞凋亡,药物诱导后细胞增殖变慢,贴壁性降低,形态变得不规则,见核固缩、核碎裂及核溶解,提取DNA凝胶电泳药物作48h后,可见凋亡典型的DNA梯状条带,并随药物浓度增加越明显细胞核碎裂;流式测细胞凋亡率,浓度为0、2.5、5、10mg/L的TVO,A375人恶性黑色素瘤细胞凋亡率分别为0、12.7、13.6、15.4%,死亡率仅为0.1%;Western blot测浓度为(0、2.5、5、10mg/L)TVO作用48h后,随药物浓度增高,凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-1、TNR-α的表达量逐渐增多,凋亡抑制相关蛋白BIRC7、TAK1、JNK1、TAB1表达量逐渐减少,与0mg/L相比P<0.05。
结论：TVO对A375人恶性黑色素瘤细胞有抑制增殖作用,同时有促其凋亡作用,具有抗肿瘤细胞功效。其机制之一是通过下调细胞凋亡抑制蛋白BIRC7表达,激活细胞凋亡途径关键酶Caspase-3,进而抑制A375人恶性黑色素瘤细胞细胞分化、增殖与促进凋亡。
参考文献
[1]Allyl‐isatin suppresses cell viability,induces cell cycle arrest,and promotes cell apoptosis in hepatocellular carcinoma HepG2 cells.Weihua Bian;;Yukuan An;;Huiqing Qu;;Yue Yang;;Junhou Yang;;Yanyan Xu.Fundamental&Clinical Pharmacology,2016
[2]Melanoma therapy:Check the checkpoints.Masutaka Furue;;Takafumi Kadono.J Dermatol,2016
[3]BRAFp.V600E,p.V600K,and p.V600R Mutations in Malignant Melanoma:Do They Also Differ in Immunohistochemical Assessment and Clinical Features?.Giovanni Ponti;;Aldo Tomasi;;Antonio Maiorana;;Cristel Ruini;;Monia Maccaferri;;Anna M.Cesinaro;;Roberta Depenni;;Paola Manni;;Fabio Gelsomino;;Francesca Giusti;;Lorella Garagnani;;Giovanni Pellacani.Applied Immunohistochemistry&Molecular Morpholo,2016
[4]Synergistic effects of Artemisia iwayomogi and Curcuma longa radix on high-fat diet-induced hyperlipidemia in a mouse model.Jong-Min Han;;Jin-Seok Lee;;Hyeong-Geug Kim;;In-Chan Seol;;Hwi-Jin Im;;Jung-Hyo Cho;;Chang-Gue Son.Journal of Ethnopharmacology,2015
[5]荣冬芸.姜黄挥发油对人恶性黑色素瘤细胞株A375细胞增殖凋亡的影响及其机制初步研究[D].贵州医科大学,2018.