大肠弯曲杆菌PCR试剂盒的应用

2023/11/28 8:34:44

背景[1-3]

大肠弯曲杆菌PCR试剂盒是一种用于检测大肠弯曲杆菌的生物试剂,具有高特异性、高灵敏度和高重现性等特点。

PCR(聚合酶链式反应)是一种用于快速、灵敏地检测特定DNA序列的分子生物学技术。大肠弯曲杆菌PCR试剂盒利用这一技术,针对大肠弯曲杆菌的特异性基因序列进行检测。

使用大肠弯曲杆菌PCR试剂盒进行检测时,需要将待测样本加入试剂盒中,经过一系列的反应和扩增后,如果检测到特异性的基因序列,则可以判断样本中存在大肠弯曲杆菌。

大肠弯曲杆菌.png

大肠弯曲杆菌

使用大肠弯曲杆菌PCR试剂盒进行检测的具体操作步骤如下:

1.准备样品:将待测样本进行预处理,如DNA提取、纯化等步骤,以便后续的PCR反应。

2.设计引物:根据大肠弯曲杆菌的特异性基因序列,设计一对引物,用于PCR反应的扩增。

3.配置反应液:将PCR反应液进行配置,包括DNA模板、引物、dNTPs等反应成分。

4.设定PCR仪程序:根据试剂盒说明书上的设定程序,将PCR仪进行设定,如循环次数、反应温度等。

5.进行PCR反应:将配置好的反应液加入PCR仪中,按照设定的程序进行PCR反应。

6.分析结果:在PCR反应结束后,对结果进行分析,如出现特异性的扩增产物,则可判断样本中存在大肠弯曲杆菌。

应用[4-5]

大肠弯曲杆菌PCR试剂盒可以用于空肠弯曲杆菌基因诊断方法的建立及其应用

空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一,对动物也能致病。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态(Viable but nonculturable,VNC),所以传统的生化鉴定结果不一定可靠,并且是一项费时而繁琐的工作。因此建立一种快速、简洁、准确、敏感的检测食品和水中空肠弯曲杆菌方法,并对国内食品和水中空肠弯曲杆菌污染情况进行调查是一个重要的研究课题。

本实验研究根据空肠弯曲杆菌VS1基因的序列设计一对特异引物(VS-F和VS-R),使用大肠弯曲杆菌PCR试剂盒建立了一种快速从食品和水中检测空肠弯曲杆菌的定性PCR方法,并在此基础上以LightCycler为平台建立了两种定量检测空肠弯曲杆菌的实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR)。一种是利用SYBRⅠ染料能特异与双链DNA结合而发荧光的特性,使用大肠弯曲杆菌PCR试剂盒建立real-time PCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌;另外一种是利用荧光能量传递技术(Fluorescene resonance energy transfer,FRET)和DNA合成酶的5’→3’活性,设计一条TaqMan探针,建立real-time PCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。

研究表明,三种PCR方法对空肠弯曲杆菌能特异的扩增出358bp片段,而其它结肠弯曲杆菌、胎儿弯曲杆菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、沙门氏菌、大肠杆菌等均不能扩增出该片段,并且两种real-time PCR方法整个实验能在60min内完成。三种PCR方法的敏感度分别为8CFU/ml,5CFU/ml和5CFU/ml。

用培养法、大肠弯曲杆菌PCR试剂盒定性PCR方法和基于TaqMan探针的real-time PCR方法对南京地区的屠宰场、超市和牛奶场等地300份鸡肉、300份生牛奶及300份井水及自来水进行空肠弯曲杆菌调查。大肠弯曲杆菌PCR试剂盒定性PCR方法结果表明,30.6%(92/300)的鸡肉为阳性、27.3%(82/300)的生牛奶为阳性、13.6%(41/300)的水为阳性。Real-time PCR定量检测结果表明三种样品受空肠弯曲杆菌污染的程度较重。对用培养法和PCR法的检测结果进行比较,提示被PCR检测出来的空肠弯曲杆菌有一部分是死菌或VNC。

参考文献

[1]Rapid detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from clinical specimens using the polymerase chain reaction.V.Stonnet;;L.Sicinschi;;F.Mégraud;;J.L.Guesdon.European Journal of Clinical Microbiology&Infectious Diseases,1995

[2]Cloning and characterization of genes coding for ribosomal RNA inCampylobacter jejuni.Ayoub Raschtchian;Mark A.Abbott;Marilee Shaffer.Current Microbiology,1986

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[4]Sutherland,and R.J.Owen.Inhibition of DNase activity in PFGE analysis of DNA from Campylobacter jejuni.Gibson,J.R.K.Lett.Appl.Microbiol.1994

[5]阳成波.空肠弯曲杆菌基因诊断方法的建立及其应用[D].南京农业大学,2003.

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