背景[1-3]
猪肾细胞系是一种来源于猪肾脏的细胞系，通常用于研究肾脏疾病的发病机制、药物筛选和毒性评价等方面。这种细胞系可以通过将猪肾脏组织进行体外培养而获得，具有较高的增殖能力和稳定性，可以长期保存和使用。猪肾细胞系在医学研究中具有重要的应用价值，可以为肾脏疾病的治疗提供新的思路和方法。
猪肾细胞系具有一些特点，包括上皮细胞样形态、贴壁生长、传代比例较高等。它们通常被用于研究猪的嵌杯状病毒、猪细小病毒、水泡性口炎病毒、非洲猪瘟病毒等猪病毒的增殖和传播机制。这些细胞系对于了解猪病毒性疾病的传播途径、控制和治疗策略具有重要意义。
在实验室中，猪肾细胞系通常使用DMEM培养基进行培养，并添加10%的胎牛血清以提供必要的营养物质。这些细胞系也可以用于制备疫苗和评估疫苗的效果，以及研究其他猪病原体的传播和致病机制。
猪肾细胞系
猪肾细胞系培养操作：
1)复苏猪肾细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)猪肾细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)猪肾细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
猪肾细胞系可以用于TANK结合激酶1基因敲除PK15细胞系的构建
天然免疫是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线。TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键激酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。
为研究TBK1在伪狂犬病毒复制过程中的作用,本试验利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术构建了猪TBK1基因稳定敲除猪肾细胞系。首先针对TBK1基因外显子2区设计3条单链向导RNA(Single guide RNA,sgRNA)并在退火后将其连接到经BsmbⅠ核酸内切酶切割过的载体质粒LentiCRISPR v2上得到重组质粒,然后将重组质粒和pMD2.G、psPAX2两种包装质粒共转染至人胚肾细胞HEK293T/17获取慢病毒并感染猪肾细胞(Porcine kidney 15,PK15)。用含嘌呤霉素(Puromycin)的培养基压力筛选获得TBK1基因敲除多克隆细胞系后提取细胞基因组,PCR扩增目的片段并将扩增产物退火,然后用T7核酸内切酶检测三条sgRNA的编辑效率。
选取编辑效率最高的多克隆细胞系通过有限稀释法,获得TBK1基因敲除单克隆细胞系(PK15-TBK1-/-)。随后利用CCK-8检测敲除TBK1基因对猪肾细胞系PK15细胞活力的影响;通过PRV-GFP感染细胞后利用荧光倒置显微镜和流式细胞仪检测GFP荧光蛋白表达强度及荧光细胞阳性率;PRV-QXX感染细胞后利用RT-qPCR检测PRV gB、gE、TK和IL-1β、IFN-β、ISG15基因mRNA表达水平;Western Blot检测PRV gB、gE蛋白表达水平以及TCID50滴度测定子代病毒的感染力来综合评价PK15-TBK1-/-细胞系的功能。经过DNA测序和序列比对,可以证明重组质粒构建成功。T7检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均有显著编辑。
选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1多克隆细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,选取4号细胞株进行后续试验。结果显示敲除TBK1基因对PK15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总猪肾细胞系PK15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明敲除TBK1基因促进PRV-GFP复制。RT-qPCR结果显示PRV-QXX感染后PK15-TBK1-/-细胞中PRV gB、gE、TK mRNA表达高于PK15细胞,而IL-1β、IFN-β、ISG15 mRNA表达低于猪肾细胞系PK15细胞。Western Blot检测显示,PRV-QXX感染相同时间后PK15-TBK 1-/-细胞中PRV gB和PRV gE蛋白表达高于PK15细胞。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK15细胞复制后病毒滴度为106.8 TCID50·0.1 mL-1,而在PK15-TBK1-/-细胞中复制后病毒滴度为108.5 TCID50·0.1 mL-1。以上结果表明,该试验成功构建了稳定敲除TBK1基因的PK15细胞系,该细胞系为深入研究PRV感染机制提供了有效工具。
参考文献
[1]High-throughput screening for small molecule inhibitors of the type-I interferon signaling pathway.Elita Yuliantie;;Xinchuan Dai;;Dehua Yang;;Peter J.Crack;;Ming-Wei Wang.Acta Pharmaceutica Sinica B,2018
[2]Ctenopharyngodon idella TBK1 activates innate immune response via IRF7.Ningli Yu;;Xiaowen Xu;;Guoqin Qi;;Dan Liu;;Xin Chen;;Xiaoqin Ran;;Zeyin Jiang;;Yinping Li;;Huiling Mao;;Chengyu Hu.Fish and Shellfish Immunology,2018
[3]Micropterus salmoides rhabdovirus(MSRV)infection induced apoptosis and activated interferon signaling pathway in largemouth bass skin cells.E-Bin Gao;;Guifang Chen.Fish and Shellfish Immunology,2018
[4]CRISPR/Cas9:A tool for immunological research.Katharina Hochheiser;;Andrew J Kueh;;Thomas Gebhardt;;Marco J Herold.European Journal of Immunology,2018
[5]刘晓贺.TANK结合激酶1基因敲除PK15细胞系的构建[D].河南农业大学,2020.