背景[1-3]
9L大鼠胶质瘤细胞系是一种常用的实验细胞系，用于研究肿瘤细胞生物学、药物筛选和肿瘤治疗等。该细胞系是由Fischer 344 H-2081细胞系衍生而来的，具有上皮细胞样的细胞形态，贴壁生长，属于大鼠胶质瘤细胞系。
9L大鼠胶质瘤细胞系在实验中具有稳定性好、生长速度快、容易传代等特点，被广泛应用于神经科学、药理学、毒理学等领域。此外，该细胞系还可用于制备组织工程材料和药物筛选等。
9L大鼠胶质瘤细胞系
9L大鼠胶质瘤细胞系具有以下特点：
高度增殖能力：9L大鼠胶质瘤细胞系具有高度增殖能力，可以在体外快速生长和繁殖。
多向分化潜能：9L大鼠胶质瘤细胞系可以分化为多种类型的细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。
稳定遗传性：9L大鼠胶质瘤细胞系具有稳定的遗传性，可以在多次传代中保持其基因型和表型特征。
可操作性好：9L大鼠胶质瘤细胞系易于操作和培养，可以在实验室中进行大规模的实验研究。
9L大鼠胶质瘤细胞系培养操作
1)复苏9L大鼠胶质瘤细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)9L大鼠胶质瘤细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)9L大鼠胶质瘤细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
9L大鼠胶质瘤细胞系可以用于脑肿瘤干细胞RNA致敏树突状细胞治疗9L脑肿瘤的实验研究
研究选用9L大鼠胶质瘤细胞系作为研究对象,首先,利用无血清悬浮培养法从9L大鼠胶质瘤细胞系中诱导培养出胶质瘤干细胞样细胞,并对其干细胞特性进行观测。然后,提取9L脑肿瘤干细胞及9L贴壁细胞总RNA,转染F344骨髓源性DCs,制备DC疫苗；最后,建立9L/F344大鼠颅内胶质瘤模型,对其进行DC疫苗治疗,观察脑胶质瘤干细胞RNA致敏DC的疗效。第一部分大鼠9L脑肿瘤干细胞的培养和鉴定
建立9L大鼠胶质瘤细胞系的体外培养和扩增方法,并从细胞形态、特异性标志物的表达及其致瘤性进行观察。
方法：选择9L大鼠胶质瘤细胞系,分别应用含血清培养基(DMEM/F12+10%FBS)和无血清培养基(DMEM/F12+20ng/mLbFGF+20ng/mLEGF)培养。通过无血清悬浮培养方法,从大鼠9L胶质瘤细胞系中培养获得呈悬浮生长的9L肿瘤球；对9L肿瘤球细胞的一般形态、免疫表型、多向分化能力进行观察。为对比9L贴壁细胞和9L肿瘤球细胞致瘤性的差异,将9L胶质瘤细胞及9L肿瘤球细胞分别注射入宿主近交系F344大鼠右侧尾状核,对肿瘤组织进行CD133和Nestin免疫组织化学检测,并对动物生存期进行观察。
结果：9L大鼠胶质瘤细胞系细胞在含血清培养基中呈贴壁生长,长出突起,呈短梭形、长梭形、星形、长纤维形；9L胶质瘤细胞在无血清培养基中,则呈悬浮状态生长,形成悬浮肿瘤克隆球,这些肿瘤球经0.01%胰酶消化后,能传代至少1个月以上。经免疫组织化学染色及流式细胞仪检测,大部分贴壁9L细胞及9L肿瘤球细胞均表达CD133和Nestin。将9L肿瘤球转入含血清培养基中,进行诱导分化,能产生表达神经元(NSE)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(Galc)的子代肿瘤细胞。将贴壁9L细胞及9L肿瘤球细胞接种入近交系F344大鼠颅内后14天,贴壁9L细胞与9L肿瘤球细胞所形成的肿瘤表型相似,经免疫组织化学染色发现,两者形成的肿瘤均呈CD133和Nestin阳性。9L肿瘤球细胞注射组所形成的肿瘤体积较大,更具侵袭性,其浸及周围正常脑组织的范围更广。
注射9L大鼠胶质瘤细胞系细胞组大鼠的中位生存期为21天,而注射9L肿瘤球细胞组的中位生存期为15天,经Kaplan-Meier分析,发现荷9L肿瘤球细胞组的生存期明显短于注射贴壁9L细胞组(P<0.001)。
结论：9L大鼠胶质瘤细胞系中存在具无限增殖、自我更新及多向分化潜能的肿瘤干细胞样细胞,利用含bFGF和EGF的无血清培养基可对大鼠9L胶质瘤细胞系中的肿瘤干细胞样细胞进行有效扩增。但CD133和Nestin不能作为9L肿瘤干细胞的特异性标志物,9L脑肿瘤干细胞仅是CD133阳性细胞中的一部分。
参考文献
[1]Brain tumor stem cells:The cancer stem cell hypothesis writ large.Peter B.Dirks.Molecular Oncology,2010
[2]Brain tumor stem cells.Thomas Palm;;Jens C.Schwamborn.Biological Chemistry,2010
[3]Antitumor Immunity and Cancer Stem Cells.TobiasSchatton;Markus H.Frank.Annals of the New York Academy of Sciences,2009
[4]Brain Tumor Stem Cells.Zhigang Xie.Neurochemical Research,2009
[5]肖宗宇.脑肿瘤干细胞RNA致敏树突状细胞治疗9L脑肿瘤的实验研究[D].南方医科大学,2012.