背景[1-3]
小鼠骨骼肌成纤维细胞是一种实验动物细胞，来源于小鼠的腿部肌肉组织。这种细胞呈长梭形，形态不规则，属于原代细胞，具有贴壁生长的特性。推荐使用EliteCell原代成纤维细胞培养体系作为体外培养原代骨骼肌成纤维细胞的培养基。
小鼠骨骼肌成纤维细胞是一种来源于小鼠骨骼肌的成纤维细胞。该细胞系具有以下特点：
来源于小鼠：小鼠骨骼肌成纤维细胞系来源于小鼠，因此具有与小鼠骨骼肌成纤维细胞相似的形态和生理特性。
可传代性好：小鼠骨骼肌成纤维细胞系具有较高的传代稳定性，可以在体外连续培养和扩增。
可诱导分化：小鼠骨骼肌成纤维细胞系可以被诱导分化为肌管细胞、肌纤维细胞等，这为研究肌肉发育和再生提供了便利。
可进行基因编辑：小鼠骨骼肌成纤维细胞系可以通过基因编辑技术进行基因改造，这为研究肌肉相关疾病的发生机制和治疗方法提供了新的思路。
小鼠骨骼肌成纤维细胞系已经被广泛应用于肌肉相关疾病的研究，如肌肉萎缩症、肌肉营养不良症等。同时，它也可以作为药物筛选和毒性评价的模型，以及用于开发新型药物和治疗方法。
小鼠骨骼肌成纤维细胞
小鼠骨骼肌成纤维细胞培养操作
1)复苏小鼠骨骼肌成纤维细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)小鼠骨骼肌成纤维细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)小鼠骨骼肌成纤维细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
小鼠骨骼肌成纤维细胞可以用于LOXL2通过TGF-β1/p38 MAPK通路调控D-半乳糖诱导骨骼肌纤维化的机制研究
LOXL2通过TGF-β1/p38 MAPK通路调控成纤维细胞参与骨骼肌纤维化目的探讨应用p38 MAPK抑制剂对(1)过表达LOXL2的成纤维细胞和(2)施用选择性LOXL2抑制剂的D-半乳糖诱导成纤维细胞的作用,以明确LOXL2调控骨骼肌纤维化的信号通路,为后续动物研究提供实验基础。
方法(一)小鼠骨骼肌成纤维细胞培养于含有20%胎牛血清的完全培养基中。当细胞生长至50%融合时,对成纤维细胞转染LOXL2过表达质粒,并施用选择性p38 MAPK抑制剂(SB 203580),孵育72小时后收集细胞;
(二) 小鼠骨骼肌成纤维细胞培养于含有20%胎牛血清的完全培养基中。当细胞生长至50%融合时,向完全培养基中加入30 g/L D-半乳糖同时加入不同浓度(0.25,0.5,1μM)选择性LOXL2抑制剂,培养72小时后收集细胞;
(三) 小鼠骨骼肌成纤维细胞培养于含有20%胎牛血清的完全培养基中。当细胞生长至50%融合时,向完全培养基中加入30 g/L D-半乳糖及选择性LOXL2抑制剂(HY-101771A)和p38 MAPK抑制剂(SB 203580),培养72小时后收集细胞。获得的细胞进行SA-β-gal染色;Collagen-I和TGF-β1免疫荧光染色;细胞内ROS流式检测;小鼠骨骼肌成纤维细胞内ATP含量检测;线粒体Mito SOX染色;线粒体膜电位染色;衰老相关蛋白,纤维化相关蛋白及LOXL2,p38,p-p38蛋白表达水平检测。
结果1、与Ad-LOXL2组相比,SB 203580组磷酸化p38表达水平显著降低;Collagen-I相对荧光强度显著减小;Vimentin和α-SMA表达水平显著降低;ROS产生减少;线粒体膜电位升高;
2、与D-半乳糖组相比,随着选择性LOXL2抑制剂浓度升高,SA-β-gal阳性细胞逐渐减少;0.5和1μM LOXL2抑制剂显著降低衰老相关蛋白表达水平;Collagen-I的相对荧光强度显著减低;1μM LOXL2抑制剂显著降低纤维化相关蛋白表达水平;细胞内ROS的产生显著降低;细胞内ATP含量显著增加;线粒体ROS产生显著减少;线粒体膜电位显著升高。
3、与LOXL2抑制剂组相比,SB 203580进一步抑制了p38的磷酸化水平,进一步抑制了Collagen-III,Collagen-I和α-SMA的表达水平。
结论1、SB 203580改善过表达LOXL2小鼠骨骼肌成纤维细胞胶原蛋白沉积和线粒体功能损害;
2、LOXL2抑制剂减轻D-半乳糖诱导小鼠骨骼肌成纤维细胞衰老,细胞外胶原蛋白沉积和线粒体功能损害;
3、联合应用SB 203580和LOXL2抑制剂进一步缓解D-半乳糖诱导小鼠骨骼肌成纤维细胞胶原沉积水平;
4、LOXL2通过TGF-β1/p38 MAPK通路介导成纤维细胞胶原沉积和促纤维化蛋白表达参与骨骼肌纤维化调控。
参考文献
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[3]Electroacupuncture regulates inflammation,collagen deposition and macrophage function in skeletal muscle through the TGF-β1/Smad3/p38/ERK1/2 pathway.[J].Han Hong;Li Ming;Liu Huilin;Li Haohan.Experimental and therapeutic medicine,2021
[4]Systemically Administered Homing Peptide Targets Dystrophic Lesions and Delivers Transforming Growth Factor-β(TGFβ)Inhibitor to Attenuate Murine Muscular Dystrophy Pathology[J].Iqbal Aqsa;May Ulrike;Prince Stuart N.;Järvinen Tero A.H.;Heydemann Ahlke.Pharmaceutics,2021
[5]吴永鑫.LOXL2通过TGF-β1/p38 MAPK通路调控D-半乳糖诱导骨骼肌纤维化的机制研究[D].重庆医科大学,2023.