背景[1-3]
ND723鼠神经母细胞瘤细胞系是一种鼠神经母细胞瘤细胞系，通常用于神经科学和神经肿瘤学的研究。这种细胞系是由神经母细胞瘤细胞系ND7经过亚克隆形成的，具有稳定的遗传学特性和肿瘤特征。
ND7/23细胞系通常用于研究神经母细胞瘤的发生、发展、治疗和药物筛选等方面的实验。这些研究有助于深入了解神经母细胞瘤的生物学特性和治疗策略，为临床诊断和治疗提供重要的参考依据。
ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系是一种来源于小鼠的神经母细胞瘤细胞系。该细胞系具有以下特点：
来源于小鼠：ND7/23细胞系来源于小鼠，因此具有与小鼠神经母细胞瘤相似的形态和生理特性。
高度恶性：ND7/23细胞系是一种高度恶性的肿瘤细胞系，可以在体外快速增殖并形成肿瘤。
可传代性好：ND7/23细胞系具有较高的传代稳定性，可以在体外连续培养和扩增。
可诱导分化：ND7/23细胞系可以被诱导分化为多种不同类型的细胞，如神经元、胶质细胞等，这为研究神经母细胞瘤的发生和发展提供了便利。
ND7-23鼠神经母细胞瘤细胞系
ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系细胞培养操作
1)复苏ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系可以用于PINK1/Parkin途径的线粒体自噬受损在高糖引发感觉神经元氧化损伤中的作用
利用小鼠神经母细胞瘤和大鼠DRG杂交的细胞株(ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系)探究在高糖环境下,PINK1/Parkin途径的线粒体自噬受损在引发感觉神经元氧化损伤中的作用,为预防与治疗DPNP提供一定理论依据。
研究目的:1.观察不同浓度葡萄糖处理不同时间对ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系细胞线粒体自噬及氧化损伤的影响,建立高糖损伤模型。
2. 通过调控PINK1的表达,探究PINK1/Parkin途径的线粒体自噬受损在高糖中引发感觉神经元氧化损伤的机制。
研究方法:1.测定ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系细胞在葡萄糖浓度梯度(25mM、50mM、75mM)以及时间梯度(24 h、48 h、72 h)干预后细胞活力的变化,通过western blot检测葡萄糖浓度梯度以及时间梯度干预后PINK1/Parkin途径的线粒体自噬关键蛋白和凋亡相关蛋白的表达变化;通过免疫荧光检测ND7/23细胞高糖下COXIV-LC3B(自噬体形成)和COXIV-LAMP1(自噬溶酶体形成)的共定位的情况、线粒体自噬、线粒体膜电位和线粒体ROS水平。最终确定模型的最佳葡萄糖浓度与干预时间。
3. 通过转染siRNA的方式敲低ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系细胞PINKI表达,分组设置为:阴性对照siRNA对照组;PINK1-siRNA对照组;阴性对照siRNA的高糖组;PINKl-siRNA的高糖组。测定各组细胞活力的变化,通过western blot检测PINK1/Parkin途径的线粒体自噬关键蛋白和凋亡相关蛋白的表达变化;通过免疫荧光检测COXIV-LC3B和COXIV-LAMPI的共定位的情况、线粒体自噬、线粒体膜电位和线粒体ROS水平。
研究结果:1.建立线粒体自噬受损高糖体外模型(50mM葡萄糖,干预48h),其PINK1表达、Parkin磷酸化程度降低、线粒体自噬受抑制、凋亡激活、线粒体膜电位下降、线粒体ROS增加。
2. 抑制PINKI表达后,高糖下ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系细胞线粒体自噬进一步受抑制、凋亡激活、线粒体膜电位进一步下降、线粒体ROS进一步增加。
研究结论:1.在高糖下,PINKI/Parkin途径的线粒体自噬受损,会导致线粒体功能障碍加重,导致ND7/23鼠神经母细胞瘤细胞系细胞氧化损伤,激活细胞凋亡通路。
2.抑制PINKI表达降低了Parkin磷酸化的比例,使线粒体功能障碍进一步加重,加重线粒体自噬受损程度,加重氧化损伤程度,激活细胞凋亡通路。
参考文献
[1]XBP1 deficiency promotes hepatocyte pyroptosis by impairing mitophagy to activate mtDNA-cGAS-STING signaling in macrophages during acute liver injury[J].Liu Zheng;Wang Mingming;Wang Xun;Bu Qingfa;Wang Qi;Su Wantong;Li Lei;Zhou Haoming;Lu Ling.Redox Biology,2022
[2]Poly(ADP-ribose)polymerase 1-mediated defective mitophagy contributes to painful diabetic neuropathy in the db/db model.[J].Yuan Pengfei;Song Fuhu;Zhu Pian;Fan Keke;Liao Qinming;Huang Lijin;Liu Zhongjie.Journal of neurochemistry,2022
[3]Current views of diabetic peripheral neuropathic pain comorbid depression-a review.[J].Wei KS;Gu MZ;Zhu JW;Hu HC;Yin LP.European review for medical and pharmacological sciences,2020
[4]Challenges of neuropathic pain:focus on diabetic neuropathy.[J].Rosenberger Daniela C;;Blechschmidt Vivian;;Timmerman Hans;;Wolff André;;Treede Rolf-Detlef.Journal of neural transmission(Vienna,Austria:1996),2020
[5]陈畯.PINK1/Parkin途径的线粒体自噬受损在高糖引发感觉神经元氧化损伤中的作用[D].南方医科大学,2023.