背景[1-3]
腺病毒转化的人胚肾细胞是一种通过腺病毒载体转化的人胚肾细胞，通常用于研究目的。这种细胞系具有某些特殊的生物学特性，例如可以表达异常的玻连蛋白的细胞表面受体，由整合素β1亚单位和玻连蛋白受体α-v亚单位组成。
腺病毒转化的人胚肾细胞是一种通过腺病毒感染人胚肾细胞而获得的细胞系。这种细胞系通常用于研究腺病毒的感染机制、免疫反应以及病毒与宿主细胞之间的相互作用等。
腺病毒是一种常见的病毒，可以引起多种疾病，包括呼吸道感染、胃肠道感染和眼部感染等。在人体内，腺病毒主要感染上皮细胞和内皮细胞，包括呼吸道、肠道和泌尿生殖道等部位的细胞。
通过将腺病毒转化的人胚肾细胞进行体外培养和研究，科学家们可以深入了解腺病毒的感染机制和免疫反应。例如，他们可以研究腺病毒如何进入宿主细胞、如何复制自身以及如何逃避宿主的免疫系统等。此外，这些细胞系还可以用于开发疫苗和药物，以预防和治疗腺病毒感染相关的疾病。
腺病毒转化的人胚肾细胞可以通过腺病毒转化来获得，转化效率高，可以在短时间内获得大量的转化细胞。同时，这种细胞系还可以用于基因表达和蛋白表达等方面的研究，为生物医学研究提供了重要的实验工具。
腺病毒转化的人胚肾细胞
腺病毒转化的人胚肾细胞培养操作
1)复苏腺病毒转化的人胚肾细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)腺病毒转化的人胚肾细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)腺病毒转化的人胚肾细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
腺病毒转化的人胚肾细胞可以用于外泌体AAV递送NLS-CBFβ的系统构建及诱导MSCs成软骨分化的研究
构建外泌体AAV基因载体递送核定位信号(NLS)修饰的核结合因子(CBFβ),探讨其诱导关节液来源间充质干细胞(SF-MSCs)成软骨细胞分化的效应,旨在为外泌体AAV递送核结合因子诱导SFMSCs治疗骨关节炎提供一种新的思路。
方法:通过分子生物学方法,构建p AAV-NLS-CBFβ-RFP和p AAVCBFβ-RFP表达质粒;采用PEI转染法分别将p AAV-NLS-CBFβ-RFP/p AAV-CBFβ-RFP表达质粒和p AAV-RC、p AAV-Helper质粒共转染至腺病毒转化的人胚肾细胞AAV-293细胞中,包装并生产携带NLS的CBFβ以及CBFβ的重组腺相关病毒r AAV-NLS-CBFβ-RFP和r AAV-CBFβ-RFP;收集包装后的腺病毒转化的人胚肾细胞AAV-293细胞与培养基上清,提纯病毒,以及超高速差速离心法提取包含r AAV-NLS-CBFβ-RFP和r AAV-CBFβ-RFP的外泌体(Exosomes);将收集的病毒、外泌体进一步转染SF-MSCs。通过倒置显微镜及激光共聚焦显微镜观察荧光染色观察转染后SF-MSCs荧光情况,通过q RT-PCR检测SF-MSCs的CBFβ基因表达情况,通过Western Blot检测SF-MSCs的CBFβ、Collagen II以及Aggrecan的蛋白表达情况。
结果:双酶切琼脂糖凝胶电泳及DNA测序结果提示NLS-CBFβ、CBFβ已成功构建到表达质粒p AAV-NLS-CBFβ-RFP、p AAV-CBFβ-RFP中;质粒转染腺病毒转化的人胚肾细胞AAV-293细胞后,倒置显微镜下观察到腺病毒转化的人胚肾细胞AAV-293细胞表达红色荧光蛋白,结果提示病毒包装成功。病毒感染SF-MSCs后,通过激光共聚焦显微镜,观察到NLSCBFβ组和CBFβ组的SF-MSCs表达红色荧光,而空白组未见红色荧光;与CBFβ组相比,NLS-CBFβ组红色荧光集中在细胞核,提示NLSCBFβ基因表达后进入细胞核发挥生物学功能。对提取的外泌体进行纳米粒径分析,发现外泌体的平均直径为159 nm,其中分布最多的是139 nm,直径在124～201 nm之间的占80%,说明得到的外泌体纯度较高。Simple western实验分析了腺病毒转化的人胚肾细胞AAV-293细胞与外泌体的表面标记物(Calnexin、CD81、CD63、TSG101),结果显示外泌体标志蛋白CD81、CD63、TSG101阳性,而Calnexin呈阴性,符合外泌体的鉴定标准。流式细胞技术分析结果显示,收集并培养的SF-MSCs的CD34(0.6%)和CD45(0.2%)呈阴性,CD90(98.2%)、CD73(100.0%)和CD105(93.2%)呈阳性,符合MSCs的蛋白表型。
参考文献
[1]Exosome:A Review of Its Classification,Isolation Techniques,Storage,Diagnostic and Targeted Therapy Applications[J].Zhang Yi;Bi Jiayao;Huang Jiayi;Tang Yanan;Du Shouying;Li Pengyue.International Journal of Nanomedicine,2020
[2]Synergistic Effects of Kartogenin and Transforming Growth Factor-β3 on Chondrogenesis of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells In Vitro.[J].Zhao Yanhong;;Teng Binhong;;Sun Xun;;Dong Yunsheng;;Wang Shufang;;Hu Yongcheng;;Wang Zheng;;Ma Xinlong;;Yang Qiang.Orthopaedic surgery,2020
[3]Transforming growth factor-beta stimulates human bone marrow-derived mesenchymal stem/stromal cell chondrogenesis more so than kartogenin.[J].Music E;;Klein T J;;Lott W B;;Doran M R.Scientific reports,2020
[4]miR-381-abundant small extracellular vesicles derived from kartogenin-preconditioned mesenchymal stem cells promote chondrogenesis of MSCs by targeting TAOK1[J].Hui Jing;;Xiaoyang Zhang;;Kai Luo;;Qiancheng Luo;;Meng Yin;;Wei Wang;;Zhongqun Zhu;;Jinghao Zheng;;Xiaomin He.Biomaterials,2020
[5]关天富.外泌体AAV递送NLS-CBFβ的系统构建及诱导MSCs成软骨分化的研究[D].汕头大学,2023.