背景[1-3]
正常人表皮角质形成细胞是一种皮肤细胞，也称为角质细胞。它们是表皮的最外层细胞，主要负责保护皮肤免受外界环境的伤害。
正常人表皮角质形成细胞具有以下特点：
形态特征：正常人表皮角质形成细胞呈多角形或长条形，大小不一，有明显的核仁和胞质。
生长特性：正常人表皮角质形成细胞具有较强的增殖能力，可以在体外持续传代，并且可以在体内形成新的角质细胞。
基因表达：正常人表皮角质形成细胞通常表达多种与角质形成相关的基因，如keratin、loricrin等。
正常人表皮角质形成细胞在生物学研究中具有广泛的应用价值，例如用于研究皮肤发育和修复机制、筛选抗衰老药物、评估治疗效果等。同时，由于皮肤是人体最大的器官之一，因此正常人表皮角质形成细胞也被广泛应用于皮肤病学的研究中。
正常人表皮角质形成细胞
正常人表皮角质形成细胞培养操作
1)复苏正常人表皮角质形成细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)正常人表皮角质形成细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)正常人表皮角质形成细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
正常人表皮角质形成细胞可以用于角蛋白24在表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的作用研究
利用慢病毒转染技术,构建过表达K24的真皮成纤维细胞模型,并通过qRT-PCR和Western blot法确认慢病毒的感染效率。继而主要通过qRT-PCR、Western blot法及细胞功能学实验方法研究K24过表达后对真皮成纤维细胞增殖、迁移、衰老的影响。分离培养Krt24-GFP转基因小鼠真皮成纤维细胞,通过细胞功能学检测以及qRT-PCR法,与野生型小鼠真皮成纤维细胞进行对比分析,验证前述实验结果。
[结果]一、K24在表皮角质形成细胞中的表达及作用1.Western blot结果提示,体外培养的银屑病皮损区来源的角质形成细胞中K24的蛋白表达水平低于正常角质形成细胞。
2. 细胞免疫荧光检测发现,K24在正常人角质形成细胞中呈胞浆分布;组织免疫荧光检测发现,在正常人表皮中,K24主要表达于棘细胞上层,在基底层及棘层少量表达。
3. 通过体外传代和Ca2+诱导两种方法诱导人角质形成细胞分化发现,与对照组相比,K24在衰老及分化较为明显的角质形成细胞中蛋白表达更丰富。
4. MTS及EdU检测提示,与对照组相比,正常人角质形成细胞过表达K24后,增殖能力及细胞活性降低;流式细胞周期结果显示,K24过表达的人角质形成细胞出现了细胞周期的G1/S期阻滞;Western blot结果进一步提示,增殖相关蛋白K14、K17、c-Myc表达下调;细胞周期相关蛋白p53,p21表达上调。
5. 透射电镜法及流式凋亡检测提示,K24过表达诱导自噬并促进人表皮角质形成细胞凋亡的发生;Western blot结果提示,自噬相关蛋白Atg5和Atg7,凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3表达上调。
6. Western blot结果提示,K24过表达促进人表皮角质形成细胞的分化,角质形成细胞分化相关蛋白Kl,loricrin和involucrin的表达上调。
7. 细胞免疫荧光结果提示,K24过表达诱导人表皮角质形成细胞的细胞形态发生改变,细胞骨架蛋白α-tubulin表达上调;β半乳糖苷酶检测提示,K24过表达亦促进角质形成细胞衰老的发生。
8. Transwell试验结果提示,K24过表达抑制人表皮角质形成细胞的迁移能力;Western blot结果提示,K24过表达促进角质形成细胞EMT相关蛋白E-cadherin表达上调,N-cadherin和Slug表达下调。
9.Western blot结果提示,人表皮角质形成细胞过表达K24后,与对照组正常人表皮角质形成细胞相比,PKCS蛋白磷酸化水平增加。
10.qRT-PCR结果提示,与野生型小鼠来源的表皮角质形成细胞和正常人表皮角质形成细胞相比,Krt24过表达小鼠来源的表皮角质形成细胞在过表达Krt24mRNA的基础上,低表达Krt14,高表达loricrin及involucrin,高表达p21及p53,提示Krt24转基因小鼠表皮角质形成细胞增殖能力减弱,呈趋于分化及衰老的状态。
参考文献
[1]HMGB2 holds the key to the senescence-associated secretory phenotype[J].Ana Guerrero;;Jesu?s Gil.The Journal of Cell Biology,2016(3)
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[3]In vitro biocompatibility study of keratin/agar scaffold for tissue engineering[J].Kush Kumar Nayak;;Pratima Gupta.International Journal of Biological Macromolecules,2015
[4]Molecular control of stress transmission in the microtubule cytoskeleton[J].Benjamin J.Lopez;;Megan T.Valentine.BBA-Molecular Cell Research,2015
[5]闵敏.角蛋白24在表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中的作用研究[D].浙江大学,2018.