背景[1-3]
MDA-MB-436是一种人乳腺癌细胞系，源于一名43岁患有乳腺腺癌的女性的胸腔积液。这种细胞系呈现多形性，并且在间接免疫荧光染色时与抗微管抗体呈现强烈反应。MDA-MB-436细胞系被推荐使用Leibovitz's L-15培养基进行培养，这种培养基不能通入二氧化碳，因为二氧化碳会产生细胞毒性。
MDA-MB-436(人乳腺癌细胞)细胞系属于三阴性乳腺癌细胞系，这意味着其激素受体、孕激素受体和HER2均为阴性，因此对内分泌治疗和HER2靶向治疗无效。这使得三阴性乳腺癌具有高侵袭性和低存活率，晚期主要依靠化疗来缓解。
在实验室环境中，MDA-MB-436(人乳腺癌细胞)细胞系被广泛用于乳腺癌的研究，包括发病机制、药物筛选以及治疗方法的研究。细胞培养实验室需要满足一定的要求，包括无菌环境和必要的细胞培养设备。
MDA-MB-436(人乳腺癌细胞)
MDA-MB-436(人乳腺癌细胞)培养操作
1)复苏MDA-MB-436(人乳腺癌细胞)：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)MDA-MB-436(人乳腺癌细胞)传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)MDA-MB-436(人乳腺癌细胞)冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
MDA-MB-436(人乳腺癌细胞)可以用于乳腺癌驱动基因的筛选及丹参酮ⅡA对驱动基因影响的初步探索
研究首先使用自发性乳腺癌小鼠模型MMTV-PyMT,通过灌胃给予不同剂量(30mg·kg-1和60mg·kg-1)的丹参酮ⅡA,证实了60mg·kg-1丹参酮ⅡA可以显著抑制乳腺由腺瘤向早期癌的恶变;其次利用静息态乳腺癌细胞模型MDA-MB-436(人乳腺癌细胞),丹参酮ⅡA给药处理24小时后,EdU增殖实验证实了丹参酮ⅡA体外可以抑制MDA-MB-436(人乳腺癌细胞)细胞的增殖能力;此外,我们使用Q-TRAP 4500型液相色谱-串联质谱联用仪检测了给药30分钟、1小时和2小时后的MMTV-PyMT小鼠乳腺组织和血浆中丹参酮ⅡA及其代谢产物丹参酮ⅡB和紫丹参甲素A的含量,结果表明乳腺组织中丹参酮ⅡA及其代谢产物的浓度低于血浆中含量,且在1小时左右浓度达到峰值,说明丹参酮ⅡA多数通过消化道吸收入血后,进入血液循环发挥药效,到达靶器官的药物较少。
收获了MMTV-PyMT小鼠乳腺增生、腺瘤、早期癌和晚期癌阶段的组织,其中腺瘤阶段的病变区域使用激光捕获显微切割(Laser capture microdissection,LCM)进行收集。Illumina HiSeq PE150全外显子测序,测序数据过滤后对变异信息进行挖掘。根据测序结果筛选出各个阶段的单核苷酸突变、拷贝数变异和插入缺失突变;基于拷贝数增加、单核苷酸突变(stopgain和frameshift)筛选出不同阶段的候选驱动基因,使用一代Sanger测序和qPCR对候选驱动基因进行验证,初步筛选出mid1和pitx1两个驱动乳腺由腺瘤恶变为早期癌阶段的关键基因。最后通过qPCR检测第一部分乳腺组织中候选驱动基因的表达,发现丹参酮ⅡA可以影响pitx1的表达。
[结论与意义]丹参酮ⅡA体外可以显著抑制人源乳腺癌休眠细胞MDA-MB-436(人乳腺癌细胞)的增殖,体内可以延缓MMTV-PyMT小鼠乳腺腺瘤向早期癌的恶变。通过对乳腺癌发生发展不同阶段的组织进行外显子测序,筛选出候选驱动基因。
参考文献
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