背景[1-3]
破骨细胞是一种在骨骼重塑和维持骨骼平衡中起到关键作用的细胞。它们的主要功能是通过分泌酸性物质和蛋白酶来分解骨骼，从而参与骨骼的吸收和重塑过程。
破骨细胞在骨代谢中扮演着重要的角色，与成骨细胞一起维持骨骼的动态平衡。当骨骼受到损伤或需要重塑时，破骨细胞会被激活并迁移到受损部位，开始分解骨骼。这一过程有助于清除旧的骨骼组织，为新的骨骼组织的形成提供空间。
在生物医学研究中，破骨细胞也被广泛研究，以深入了解骨代谢的调控机制和骨骼疾病的发病机制。例如，破骨细胞的异常活动可能导致骨质疏松等骨骼疾病的发生。因此，研究破骨细胞的生物学特性和功能，对于开发新的骨骼疾病治疗方法和药物具有重要意义。
破骨细胞
破骨细胞培养操作
1)复苏破骨细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)破骨细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)破骨细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
破骨细胞可以用于AKT/mTOR/ULK1介导的自噬在骨保护素调控破骨细胞骨吸收活性中的作用机制
研究以BALB/c小鼠骨髓源巨噬细胞(BMMs)分化形成的破骨细胞为研究对象,自噬抑制剂CQ、激动剂RAP和OPG处理后,从OPG对Osteoclasts Cells破骨细胞自噬的影响,自噬在OPG调控破骨细胞骨吸收过程中的作用,及AKT/mTOR/ULK1在OPG调控破骨细胞自噬过程中的作用,三方面阐明AKT/mTOR/ULK1介导的自噬在OPG调控Osteoclasts Cells破骨细胞骨吸收活性中的作用机制。为临床应用OPG治疗骨代谢疾病提供理论依据。
1. OPG对破骨细胞自噬的影响为了揭示OPG对破骨细胞自噬的影响,本研究通过添加不同浓度(0、20、40、80 ng/mL)的OPG处理细胞不同时间(0、3、6、12h),结合CQ和RAP,研究破骨细胞自噬小体及自噬流的变化,免疫荧光检测MDC和LC3荧光强度,透射电镜检测自噬小体数量。结果发现,40ng/mLOPG作用破骨细胞3h后,能够显著提高细胞的自噬水平。OPG可以减弱CQ对破骨细胞自噬的抑制作用,而RAP与OPG可以显著增强破骨细胞的自噬水平;OPG显著增强了MDC和LC3荧光强度并提升了自噬小体数量,而CQ抑制了破骨细胞自噬溶酶体的降解,MDC和LC3荧光强度增强,自噬小体数量显著减少,添加RAP促进了破骨细胞的自噬,且OPG可以增强RAP对自噬的促进效果。说明,40ng/mLOPG对分化至3d的破骨细胞自噬流有显著的促进作用,并促进了破骨细胞内自噬小体的形成。
2. 2.自噬在OPG调控破骨细胞骨吸收中的作用为了阐明自噬在OPG调控破骨细胞骨吸收过程中的作用,本研究通过自噬抑制剂CQ、激动剂RAP处理破骨细胞,采用xCelligence系统实时监测细胞指数变化,骨吸收陷窝试验观察破骨细胞骨吸收能力变化,荧光定量PCR和Western blotting检测组织蛋白酶CathepsinK和抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP的基因转录和蛋白表达水平。结果发现,添加OPG和RAP处理80h均能显著抑制破骨细胞存活率,添加RAP组后期维持在较低水平;OPG和RAP处理组破骨细胞骨吸收能力较对照组显著下降,而CQ能够部分减弱OPG对破骨细胞骨吸收能力的抑制作用;RAP使CathepsinK和TRAP基因转录及蛋白表达水平显著升高,而CQ能够部分抵消OPG对CathepsinK和TRAP蛋白表达的抑制作用。说明OPG在增强破骨细胞自噬的同时显著降低了其骨重吸收能力。
3. AKT/mTOR/ULK1信号通路在OPG调控破骨细胞自噬中的作用为了探究AKT/mTOR/ULK1信号通路在OPG调控破骨细胞自噬中的作用,本研究利用Western blotting检测AKT、mTOR、ULK1等蛋白的磷酸化水平,免疫荧光检测LC3和LAMP2共定位,透射电镜检测双层膜结构的自噬小体。
结果发现,OPG能够剂量依赖性地降低P-AKT和P-mTOR蛋白表达,上调P-ULK1蛋白表达。OPG可以增强PI3K/AKT阻断剂LY294002对P-AKT和P-mTOR的抑制作用,同时增强了RAP对P-AKT的抑制,促进了破骨细胞的自噬,结果提示OPG通过抑制AKT/mTOR通路使破骨细胞的自噬水平增强;OPG可以显著增强LC3和LAMP2荧光强度,并呈现显著的共定位,添加自噬抑制剂3-MA可以显著减弱荧光强度,mTOR抑制剂RAP可以显著增强自噬水平,表现出荧光强度增加;OPG减弱了3-MA对破骨细胞自噬的抑制,较3-MA单独处理组,OPG和3-MA共处理组中自噬溶酶体的数量显著增多。
参考文献
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[5]孙自强.AKT/mTOR/ULK1介导的自噬在骨保护素调控破骨细胞骨吸收活性中的作用机制[D].扬州大学,2018.