背景[1-3]
肝内胆管上皮细胞是指位于肝脏内部的胆管上皮细胞，它们负责分泌胆汁并将其输送到小肠以帮助消化食物。这些细胞在维持胆道系统的正常功能中起着关键作用。
在生物医学研究中，肝内胆管上皮细胞被广泛用于研究胆道系统的生理和病理过程，以及评估新药物或治疗方法对胆道系统的影响。例如，这些细胞可以用于模拟胆道闭塞、原发性硬化性胆管炎、胆管癌等疾病的病变过程，从而深入研究这些疾病的发病机制和潜在治疗方法。
为了获取肝内胆管上皮细胞，研究人员通常需要从人体或动物体内提取并进行细胞培养。这些细胞可以在特定的培养基中生长和繁殖，并在实验室环境中用于各种研究实验。
然而，需要注意的是，由于肝内胆管上皮细胞来源于人体或动物体内，因此在实验过程中需要严格遵守伦理和安全规范，确保实验人员的安全以及细胞的纯度和活性。
肝内胆管上皮细胞
肝内胆管上皮细胞培养操作
1)复苏肝内胆管上皮细胞细胞：培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)肝内胆管上皮细胞细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)肝内胆管上皮细胞细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
肝内胆管上皮细胞细胞可以用于S100A6在原发性胆汁性胆人肝内胆管上皮细胞管炎肝内胆管上皮细胞损伤中的作用机制
以动物模型验证生物信息学预测的靶基因,同时以为研究对象,探索转录因子对靶基因启动子的调控作用机制,从而对胆汁酸诱导的Intrahepatic Bile Duct Epithelial Cells肝内胆管上皮细胞损伤在PBC发病机制所起的作用做一阐述,并对PBC患者血浆中靶基因作为诊断和分期生物标志物的价值进行评估,为PBC发病机制、疾病监测和靶向治疗提供依据。
研究对象:生物信息学分析包含来自GEO数据库的GSE79850和GSE29776芯片;小鼠模型:6-8周龄、雄性,SPF级C57BL/6J小鼠21只;选取在中国医科大学附属第一医院确诊的PBC患者145名,体检中心健康体检者110名,其中训练集包括80名PBC患者和60名健康对照者;验证集包括65名PBC患者和50名健康对照者;细胞系:肝内胆管上皮细胞细胞、293T细胞系。
研究方法:1、生物信息学分析(1)应用Gene Spring软件对GSE79850中PBC患者肝组织数据进行差异表达基因分析;对差异基因进行基因本体、通路富集和蛋白-蛋白相互作用网络分析,并在线进行文献挖掘;对PBC关键基因及其转录因子进行分析;(2)对GSE29776芯片中BDL组与sham组小鼠肝脏差异表达基因进行分析;(3)qRT-PCR法在PBC患者和健康对照者血浆中筛选并验证差异表达基因。
2、靶基因在BDL小鼠模型中的验证(1)BDL小鼠模型的建立:实验(BDL)组行胆总管结扎术;假手术(sham)组开腹后游离胆总管随即缝合;分别在术后5天、10天和15天处死小鼠取肝脏组织,行HE和Masson染色,观察肝组织纤维化程度,选取最佳建模时间;(2)免疫荧光双标记法检测BDL小鼠肝组织中肝内胆管上皮细胞细胞CK19和S100a6蛋白,验证生物信息学的预测。
3、3、S100A6在GCDC处理后肝内胆管上皮细胞细胞中的生物学功能(1)GCDC处理人肝内胆管上皮细胞时间和浓度的筛选:分别用200μM、500μM和1000μM GCDC处理人肝内胆管上皮细胞,分别培养2小时、6小时和24小时后用流式细胞仪检测细胞凋亡百分率,选取统计学差异最大的浓度和培养时间作为后续实验的条件;(2)免疫组化法检测CK19蛋白鉴定人肝内胆管上皮细胞;(3)qRT-PCR和Western Blotting法检测S100A6过表达质粒和Smart silencer转染人肝内胆管上皮细胞的干扰效率;(4)流式凋亡检测S100A6对肝内胆管上皮细胞细胞凋亡能力的影响;(5)CCK8法检测S100A6对人肝内胆管上皮细胞增殖水平的影响。
参考文献
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