背景及概述[1][2]
增强型HRP－DAB底物显色试剂盒仅限用于科研，不得作其它用途！检测方法：比色法，elisa，高效液相等。增强型HRP-DAB底物显色试剂盒中含有检测辣根过氧化物酶（HRP）的所有试剂，适合于免疫组化中的组织切片染色或Western blot 杂交的PVDF 膜、尼龙膜等的染色。经免疫反应固定的辣根过氧化物酶可以催化底物DAB在目的蛋白所在的位置转变为蓝紫色的化合物，可根据颜色反应来鉴定辣根过氧化物酶的量，进而确定目的蛋白的位置及含量。产品特点:该显色试剂盒由试剂A：DAB底物储存液；试剂B: 稳定的过氧化物；试剂C: 增色溶液组成。显色过程中需要避光，在显色后可拍照或扫描。使用A、B、C 试剂显色后的免疫组织可用Nuclear fast red 复染。应用范围:Western blot 沉淀；免疫组化；其它通过沉淀反应检测HRP 的应用。
应用 [2]
一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法，具体步骤如下：
(1)海带雌配子体细胞的转化
①生长中的海带雌配子体细胞品系13号的细胞团，研磨使之成含有5-7个细胞的 海带雌配子体细胞团，细胞密度为5×105-2×106个/mL(用血球计数板计数)。转化时用60mm 的无菌培养皿，将雌雌配子体细胞均匀平铺滤纸片中部，形成直径2cm左右的圆形轰击圈。
②用试剂盒提取质粒pBA002-z108β的DNA，用以轰击后的共培养和基因转化。
③对海带雌配子体细胞团进行轰击：打开PDS-1000\He型基因枪电源，打开氦气瓶阀门，旋转氦气调节杆，使气压高于所选可裂膜压力200psi左右，即1500psi；挡网与材料间距3cm时轰击，轰击压力为1100psi；
④向轰击后的海带配子体细胞团内加入pBA002-z108β质粒DNA，培养温度是11-13℃，光照为800Lux，共培养48小时；
⑤在草丁膦40mg/L的浓度下筛选转化的雌配子体细胞。
(2)重组玉米蛋白z108β在海带雌配子体细胞中的表达
转化后的雌配子体细胞培养28-35d，挑取克隆单独培养。将海带配子体均匀涂布 在带有滤纸的培养皿中，在解剖镜下用毛细管挑取褐色的转化体，加入培养液大量培养。培养海带雌配子体细胞的营养液为：灭菌海水中添加浓度为10.0g/L的NaNO3和浓度为1.0g/L 的KH2PO4，其中，NaNO3溶液的添加量为每升海水添加1.0-10.0mL；KH2PO4溶液的添加量为每 升海水添加0.4-1.0mL。并且每天更换一次营养液，培养温度是11-13℃，每天为光照培养14 小时、暗培养10小时，光照为800Lux；将转化体置于浓度为40mg/L的草丁膦中，选取仍为褐色的转化体培养5-10d。
对筛选出来的海带雌配子体细胞进行大规模培养，连续不停地进行PCR检测，优化 海带配子体转基因的方法，提高转化率和转化体的成活率，建立完整的海带雌配子体细胞 无性繁殖体系。海带雌配子体细胞培养两周后在草丁膦40mg/L的浓度下保持褐色，未被草丁膦杀死，也有部分海带配子体变绿，褪色，是未被转化的、不含有重组玉米蛋白z108β的雌配子体细胞。
(3)重组玉米蛋白z108β的提取和纯化
①海带雌配子体转化体细胞的破碎和分离
取0.1g样品放入液氮中研磨，加入1×样品缓冲液(sample buffer)200μL(1.0M tris-HCL(pH 6.8)1mL，10％SDS 6.0mL，β-巯基乙醇0.2mL，ddH2O 2.8mL)，混合后煮沸 5min，12000rpm离心10min；
②提取上清液并利用SDS-PAGE电泳鉴定
取20μL上清液，用于点样检验；SDS-PAGE电泳采用10％的分离胶(去离子水9.9mL， 30％丙烯酰胺8.3mL，Tris-HCL(pH 8.8)6.3mL，10％SDS 0.25mL，10％过硫酸铵(AP) 0.25mL，TEMED 0.01mL)和积层胶(无离子水5.5mL，30％丙烯酰胺3.5mL，Tris-HCL(pH 8.8) 1.5mL，10％SDS 0.08mL，10％AP 0.08mL，TEMED 0.008mL)。
蛋白样品上样，每孔20μL，80V电压下电泳30分钟后电压120V电泳60-80分钟。
③重组玉米蛋白z108β的蛋白印迹法验证和纯化
海带雌配子体细胞转化体的验证使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置进行PVDF转 膜，电流90mA，转膜100min。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的去离子水中，漂 洗1分钟，以洗去膜上的转膜液。放入封闭液中，摇床上封闭2小时。清洗后将膜浸于稀释好 的一抗(新西兰大白兔的Z108抗血清与5％脱脂奶粉的比例为1：1000)中，37℃孵育1-2h；用 10mLTBST洗膜3次；再将膜浸于稀释好的二抗(HRP标记的羊抗兔IgG与5％脱脂奶粉的比例 为1：2000)中，37℃孵育1h；用10mLTBST洗膜3次，用10mLTBS洗一次；增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显色拍照。
获得的重组玉米蛋白用8kD的再生棉绒纤维素透析膜(货号F128056-0001，上海生工)透析除盐，并12000rpm离心20分钟沉淀。
④重组蛋白的浓缩和保藏
将离心纯化的蛋白集中收集，离心纯化后的重组玉米蛋白z108β在-20℃条件下保存。经电泳蛋白标准测试，重组玉米蛋白z108β的含量达到0.2μg/μL；纯度达到 99.9％。本发明中除特殊说明外，“％”均表示质量浓度。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明首次通过海带配子体细胞的大量培养获得纯度达到99.9％的重组玉米蛋白，这一发明使得人工条件下实现目标基因编码蛋白的表达量能够满足实际应用的要求；
2、重组玉米蛋白z108β是一种具有抑制鳞翅目昆虫发育的作用，该基因在海带配子体细胞的表达使得海带雌配子体细胞成为一种可以生产生物农药的生物反应器。
3、在水生植物中表达陆生植物的重组蛋白，而且大规模培养条件下分裂的雌配子体细胞具有目标基因的遗传稳定性。
主要参考资料
[1] 增强型HRP-DAB底物显色试剂盒说明书
[2] CN201611194909.0 一种利用海带雌配子体生产重组玉米蛋白的方法