背景[1-3]
DELAFIELD苏木素染色液是一种用于生物学和医学实验的染色剂，特别适用于非木质化组织的染色。这种染色液主要由苏木精和其他成分组成，可以与番红对染，对多种植物病害组织染色能够取得良好的效果。
在染色过程中，苏木精作为一种碱性天然染料，可以使细胞核着色。这是因为细胞核内染色质的主要成分是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。
Delafield苏木素染色液的使用方法通常包括将组织切片浸泡在染色液中一定时间，然后进行清洗和分化处理。在HE染色中，常用1%盐酸乙醇作为分化液，因为酸能破坏苏木素的醌型结构，使组织与色素分离而退色。此外，染色液还需要在特定的保存条件下保存，如室温、避光等。
DELAFIELD苏木素染色液
Delafield苏木素是通过对苏木素进行自然氧化处理而制成的，这一过程涉及将苏木素暴露于光和空气中，让其自然氧化成苏木红。这个过程比较缓慢，通常需要3到6个月的时间。经过这样处理的苏木素染色能力可以维持很长时间。在使用Delafield苏木素染色液之前，建议先进行过滤，以确保染色效果。
在实验室中，Delafield苏木素染色液主要用于染色细胞核，其染色结果呈现出紫色或蓝紫色，便于在显微镜下观察和分析细胞结构。由于其优异的染色能力和较长的可用期限，Delafield苏木素染色液成为了科研和病理诊断中非常受欢迎的一种染色剂。
应用[4][5]
DELAFIELD苏木素染色液可以用于Eya2在前列腺癌中过表达，通过AKT/Bcl-2通路调控前列腺癌细胞线粒体功能及多西紫杉醇敏感性
探究Eya2在前列腺癌中的表达模式,临床意义,表达差异对前列腺癌细胞生物学功能的影响以及潜在的分子生物学机制,以判断Eya2是否可能作为前列腺癌早期诊断的生物标记物。
研究方法:1组织样本98例人类前列腺癌组织和16例前列腺正常组织来自于2013至2016年在中国医科大学附属盛京医院就诊的患者。2免疫组织化学前列腺癌组织样本切除后浸入甲醛溶液固定,石蜡包埋处理并保存。制作石蜡切片,脱蜡后经抗原修复、BSA封闭后,滴加一抗(Eya2)孵育过夜。滴加生物素标记的二抗继续孵育。抗体孵育结束后DAB显色试剂盒显色,DELAFIELD苏木素染色液复染细胞核,脱水透化后进行封片。统计染色强度和阳性百分比,估算Eya2在前列腺组织中的表达情况。3细胞培养本实验所用细胞系为:人类前列腺上皮细胞RWPE-1(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库),人类前列腺癌细胞DU145(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库),LNCaP(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库),PC-3(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库),人类293细胞(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。培养条件为:含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和链霉素的培养基,37℃恒温饱和湿度培养。4 Western Blot收集蛋白进行丙烯酰胺凝胶电泳,所用一抗为:Eya2、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、caspase3、PRAP、AKT、p-AKT、Bcl-2、MMP7和actin。样本经过辣根过氧化物酶耦合二抗孵育2小时,ECL发光。5实时定量RT-PCR使用TRIZOL提取总RNA,使用iScriptTM Reverse Transcription Supermix试剂盒进行反转录。RT-PCR使用SYBR Green MasterMix试剂采集荧光信号。所用仪器为ABI 7500。actin为内参基因,基因扩增倍数参照2-ΔΔct法。
6 Eya2质粒转染和shEya2稳转Eya2 shRNA、pMD2.G和pspax2均购于Addgene公司,使用Lipofectamine 3000进行慢病毒转染,puromycin进行细胞筛选。Eya2质粒购于Addgene公司,使用Lipofectamine 3000进行Eya2质粒转染实验。7 CCK8和集落形成实验CCK8:重悬处理后细胞,以3000个细胞/孔的密度接种于96孔板,分别在24h、48h、72h、96h使用CCK8检测细胞增殖情况,绘制折线图观测Eya2表达差异对细胞增殖的影响。集落形成实验:重悬处理后细胞,均匀接种于6cm皿中,连续培养2周。固定后吉萨姆染色液染色,晾干后采集图像。对集落进行计数,分析Eya2表达差异对集落形成的影响。8 Transwell凝胶侵袭实验将处理后细胞重悬加至包被有Matrigel的Transwell上室中。Transwell上室血清浓度为3%,下室血清浓度为13%,37℃饱和湿度培养18h。取出上室,擦去上层Matrigel,固定打孔并使用DELAFIELD苏木素染色液染色。风干后裁下基底膜,中性树胶封片。对细胞进行计数,分析Eya2表达差异对细胞侵袭能力的影响。
参考文献
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[2]A colorimetric paper sensor for citrate as biomarker for early stage detection of prostate cancer based on peroxidase-like activity of cysteine-capped gold nanoclusters[J].Shima Abarghoei;;Neda Fakhri;;Yasaman Sadat Borghei;;Morteza Hosseini;;Mohammad Reza Ganjali.Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2019
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[4]Rafoxanide,an organohalogen drug,triggers apoptosis and cell cycle arrest in multiple myeloma by enhancing DNA damage responses and suppressing the p38 MAPK pathway[J].Wenqin Xiao;;Zhijian Xu;;Shuaikang Chang;;Bo Li;;Dandan Yu;;Huiqun Wu;;Yongsheng Xie;;Yingcong Wang;;Bingqian Xie;;Xi Sun;;Yuanyuan Kong;;Xiucai Lan;;Wenxuan Bu;;Gege Chen;;Lu Gao;;Xiaosong Wu;;Jumei Shi;;Weiliang Zhu.Cancer Letters,2018
[5]刘重远.Eya2在前列腺癌中过表达，通过AKT/Bcl-2通路调控前列腺癌细胞线粒体功能及多西紫杉醇敏感性[D].中国医科大学,2021.