背景[1-3]
IARS2抗体是一种用于研究IARS2（异亮氨酰-tRNA合成酶2）的抗体，它在蛋白质合成的保真度中扮演重要角色。IARS2抗体可以用于多种实验应用，如免疫印迹（Western Blot）、免疫沉淀（Immunoprecipitation）、免疫荧光（Immunofluorescence）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。这些抗体主要针对人类、小鼠和大鼠样本中的IARS2蛋白。
不同供应商提供的IARS2抗体具有不同的特性和应用范围。例如，Proteintech提供的IARS2抗体（17170-1-AP）适用于多种物种，包括人类、小鼠、大鼠等；SCBT提供的IARS2抗体（E-2）是一种小鼠单克隆IgG1κ抗体，适用于WB、IP、IF和ELISA，检测小鼠、大鼠和人的IARS2蛋白；Abcam提供的IARS2兔多克隆抗体适用于IP和WB，与人样本反应；GeneTex提供的IARS2抗体（GTX87187）适用于WB、ICC/IF、IHC-P，与人类、小鼠、猴反应；SCBT提供的IARS2抗体（B-1）也是一种小鼠单克隆IgG3(kappa轻链)抗体，适用于WB、IP、IF和ELISA检测。
选择IARS2抗体时，应根据实验需求和样本类型来选择合适的抗体，并遵循制造商提供的操作指南和推荐稀释比。例如，根据实验目的和样本类型，可以选择特异性结合IARS2蛋白的抗体，用于阻断IARS2与相应受体的结合，从而研究其在细胞功能中的作用。
IARS2抗体
IARS2抗体在Western Blot（WB）实验中的具体步骤如下：
1.样品制备：
收集细胞或组织样本，并进行适当的处理以提取蛋白质。
制备蛋白样品，通常包括蛋白质的变性、定量等步骤。
2.蛋白分离：
使用SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）将蛋白质分离成不同的条带。
根据目的蛋白的大小，选择合适的分离胶浓度。
3.转膜：
将分离好的蛋白质从凝胶转移到PVDF膜或硝酸纤维素膜上。
转膜时，可以使用冰浴和转膜仪以提高效率和减少非特异性结合。
4.封闭：
转膜后的膜用封闭液（如5%脱脂奶粉或5%BSA）封闭，以减少非特异性结合。
封闭通常在室温下进行1-2小时。
5.抗体孵育：
将封闭后的膜与稀释的IARS2抗体孵育。
孵育条件根据抗体说明书推荐，通常在4°C过夜。
6.洗涤：
使用Tris缓冲盐水（TBS）或TBS加Tween-20（TBST）洗涤膜，以去除未结合的抗体。
重复洗涤步骤，通常需要洗涤3-5次。
7.二抗孵育：
将稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（与一抗的物种相匹配）与膜孵育。
孵育条件根据二抗说明书推荐，通常在室温下进行1-2小时。
8.洗涤：
使用TBST洗涤膜，重复洗涤步骤，以去除未结合的二抗。
9.显色：
加入显色底物（如ECL或LumiGLO）与膜孵育，根据说明书进行显色反应。
观察并记录结果，通常使用化学发光成像系统。
10.数据分析：
使用图像分析软件对条带进行分析，确定IARS2蛋白的表达水平。
对照组和实验组的结果应进行比较，以评估实验的可靠性。
应用[4][5]
IARS2抗体可以用于IARS2基因在结肠癌中的表达及功能研究
通过观察病理确诊的人结肠癌与癌旁组织中IARS2基因的表达差异、构建IARS2-siRNA慢病毒载体并感染结肠癌RKO细胞、检测敲减IARS2基因后结肠癌RKO细胞的生物学行为变化,初步探究IARS2基因与结肠癌的关系。
研究目的：1、明确结肠癌组织与不同结肠癌细胞株中IARS2基因的表达水平。2、从细胞水平探索敲减IARS2基因对结肠癌RKO细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。
方法：1、对接受结肠癌手术治疗并经病理确诊的6例结肠癌患者的癌组织及健康结肠组织(距原发肿瘤10cm以上组织)进行取材,用实时荧光定量PCR检测IARS2基因在人结肠癌与健康结肠组织的表达水平,用2-ΔΔct分析法比较IARS2基因在人结肠癌与健康结肠组织之间的表达差异。通过实时荧光定量PCR检测IARS2基因在不同的结肠癌细胞株(RKO、SW480、HCT116、DLD1、HT-29、SW620)中的表达水平,用2-ΔΔct分析法比较IARS2基因在不同结肠癌细胞之间的表达差异。
2、设计IARS2-siRNA序列并制备含有IARS2-siRNA序列的重组质粒转染大肠杆菌,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定及测序比对,验证扩增出的重组质粒中是否含有IARS2-siRNA序列。使用IARS2抗体进行Westernblot检测,同时选用RNAi外源筛靶的方法验证靶点干扰的有效性。用含IARS2序列并带有Flag标记的质粒与含IARS2-siRNA的质粒共转染293T细胞作为实验组,对照组将RNAi质粒换为含阴性对照序列的质粒进行共转染,收集转染后36-48小时的实验组和对照组细胞,分别提取蛋白后利用IARS2抗体进行Western Blot检测,间接反映IARS2-siRNA序列能否降低细胞中IARS2基因在蛋白水平的表达。将含有IARS2-siRNA的重组质粒与两种辅助包装原件质粒共转染293T细胞并培养至48h以后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液并浓缩得到慢病毒浓缩液。将生长状态良好的RKO细胞分为两组：对照组(加入含阴性对照序列的慢病毒)和实验组(加入含IARS2-siRNA的慢病毒)进行RNA干扰实验。慢病毒感染细胞后3天在荧光显微镜下观察GFP的表达情况；慢病毒感染细胞后5天收集RKO细胞,以实时荧光定量PCR检测两组细胞IARS2基因在mRNA水平的表达情况,用2-ΔΔct分析法比较IARS2基因mRNA在实验组和对照组之间的表达差异,观察在mRNA水平IARS2基因的敲减效果。
IARS2抗体结果：1、6对人结肠癌组织和健康结肠组织(距原发肿瘤10cm以上组织)的实时荧光定量PCR检测结果提示：肿瘤组织中IARS2基因mRNA的表达水平高于健康组织；用2-ΔΔCt分析法比较后显示：结肠癌组织的IARS2基因mRNA的表达水平比健康结肠组织的表达水平平均增高近2倍,最高的超过3倍。不同结肠癌细胞的实时荧光定量PCR检测结果提示：在6个结肠癌细胞株中都有IARS2基因的表达；用2-ΔΔct分析法比较后显示：结肠癌RKO细胞株IARS2基因的mRNA表达水平明显高于结肠癌SW480、HCT116、DLD1、HT-29、SW620细胞株。
2、成功构建含IARS2-siRNA的重组质粒,阳性克隆经PCR及测序证实IARS2-siRNA序列插入正确。IARS2抗体Western blot检测提示：经转染IARS2-siRNA质粒后,细胞在IARS2蛋白水平明显降低；证明实验中构建的含IARS2-siRNA的慢病毒质粒对IARS2基因的表达有敲减作用。将IARS2-siRNA慢病毒质粒进行慢病毒包装后感染结肠癌RKO细胞,实验组和对照组的感染效率都达到80%以上。经IARS2-siRNA慢病毒感染后的RKO细胞,IARS2基因的mRNA表达水平明显低于Control组；表明IARS2-siRN A慢病毒对IARS2基因在mRNA水平的表达有敲减作用。
参考文献
[1]Mutation in The Nuclear‐Encoded Mitochondrial Isoleucyl–t RNA Synthetase IARS2 in Patients with Cataracts,Growth Hormone Deficiency with Short Stature,Partial Sensorineural Deafness,and Peripheral Neuropathy or with Leigh Syndrome[J].Jeremy Schwartzentruber;;Daniela Buhas;;Jacek Majewski;;Florin Sasarman;;Simon Papillon‐Cavanagh;;Isabelle Thiffaut;;Katherine M.Sheldon;;Christine Massicotte;;Lysanne Patry;;Mariella Simon;;Amir S.Zare;;Kevin J.McKernan;;;;Jacques Michaud;;Richard G.Boles;;Cheri L.Deal;;Valerie Desilets;;Eric A.Shoubridge;;Mark E.Samuels.Human Mutation.2014
[2]Comparison of different standards for real-time PCR-based absolute quantification[J].S.Dhanasekaran;;T.Mark Doherty;;John Kenneth.Journal of Immunological Methods,2010(1)
[3]Non-viral nanosystems for systemic siRNA delivery[J]..Pharmacological Research,2009(2)
[4]Contact X-ray Therapy for Rectal Cancer:Experience in Centre Antoine-Lacassagne,Nice,2002–2006[J]..International Journal of Radiation Oncology,Biology,Physics,2008(3)
[5]钟玲.IARS2基因在结肠癌中的表达及功能研究[D].昆明医科大学,2015.