背景[1-3]
血清封闭剂是免疫学实验中常用的一种试剂，主要用于减少或消除非特异性结合背景的影响。常见的封闭剂包括脱脂奶粉、牛血清白蛋白（BSA）、动物血清和Fab片段单链二抗等。这些封闭剂的作用是封闭固相载体上的未结合位点，从而减少一抗和二抗与非靶标位点的非特异性结合。
脱脂奶粉：便宜且适用范围较窄。由于成分复杂，可能含有生物素、碱性磷酸酶，不适合用于磷酸化蛋白检测和生物素标记的抗体系统。
牛血清白蛋白（BSA）：成分单一，适用于大多数情况。BSA可能含有少量的抗体残留，可能导致交叉反应。建议使用不含IgG的BSA产品。
动物血清：封闭血清主要用于免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）实验中样本的封闭，以降低背景和减少假阳性。血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，从而减少背景。
Fab片段单链二抗：也常用于免疫学实验中的封闭。
在选择封闭剂时，应考虑实验的具体要求，如特异性、背景信号、成本等因素。例如，在ELISA实验中，常用5%脱脂奶粉或BSA封闭膜上除转印蛋白占据的其它部位；在Western Blotting实验中，为减少非特异性条带，可在用一抗孵育前使用适当的阻断试剂阻断膜。
血清封闭剂
定义与来源
定义：血清封闭剂是将养殖的非免疫的正常动物采血后，不加抗凝剂使血液凝固，血块收缩析出的淡黄色液体，经过特殊工艺处理而成。它特别适用于各类免疫学实验中的封闭处理。
来源：通常来源于牛、羊、兔等非免疫的正常动物。
血清封闭剂作用机制
封闭剂能够占据样本中的“黏性”位点，如暴露的带电性或疏水性蛋白表面，从而阻止一抗和二抗与非靶标位点的非特异性结合。
它还可以封闭样品中内源性的Fc片段结合位点，阻断抗体与样品中的Fc受体结合，进而降低背景信号，减少假阳性结果。
血清封闭剂应用场景
血清封闭剂在免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）等实验中广泛应用，用于封闭样本中的非特异性结合位点。
它也适用于ELISA等其他免疫学实验，以提高实验的特异性和灵敏度。
血清封闭剂使用方法
血清封闭剂通常以液体形式提供（原液），无需溶解，可直接用PBS等缓冲液稀释后使用。
在实验过程中，根据实验需求将适量封闭剂加入到样本中，进行一定时间的孵育即可。
血清封闭剂储存与稳定性
血清封闭剂应储存在适当的温度下，长时间储存在2～8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。因此，推荐在-20℃以下储存血清，并避免反复冻融。
如果开盖后未使用完，建议存放于4℃，但请勿超过一个月。
应用[4][5]
血清封闭剂可以用于胃蛋白酶在喉癌中的表达及作用
利用荧光定量PCR和Western Blotting技术检测喉癌细胞在Pepsin刺激后多个上皮、间质标志物的变化情况,从而证实Pepsin是否诱导喉癌细胞发生EMT,为深入理解咽喉反流是否参与喉癌发生发展提供理论基础。
材料和方法1.临床标本收集18例声带白斑组织和21例喉癌组织均取自南方医科大学南方医院因声带白斑及喉癌(T1-3N1M0)拟行手术治疗的患者,手术中取喉病变组织标本,所有患者均尚未接受放化疗治疗。16例健康喉上皮组织在南方医院耳鼻喉科门诊表麻纤维电子喉镜下取声带近室带处游离缘处组织,所有受试者要求检查前2周内无服用质子泵抑制剂、促胃肠动力药物。本研究经南方医院伦理委员会批准,所有患者及健康志愿者均自愿加入且签署参与研究的知情同意书。2.24小时多通道腔内阻抗-pH(MII-pH)监测：采用ZepHr多通道腔内阻抗-pH监测便携系统(Sandhill scientific inc,美国)及型号ZAI-BL-48E单根分叉型电极,电极直径2.3 mm,共有6个阻抗通道,分别位于LES上方3 cm、5 Cm、7 cm、9 cm以及UES下方3 cm、5 cm；2个pH监测位点分别位于LES上方5 cm和UES上方1 cm。监测电极使用前均行pH 4.0和pH 7.0校准液定标校准。监测前患者禁食水至少8 h,取卧位,经鼻插入监测导管,根据食管动力监测定位LES位置,胸前固定外置参考电极。调整ZepHr多通道腔内阻抗-pH监测便携系统开始记录咽喉反流及胃食管反流数据。告知患者注意事项,嘱其次日同一时间返回检查室(保证检查时间大约24 h),拆除仪器,结束检查。监测记录数据处理采用Bioview反流分析软件(Sandhill Scientific),输出反流波形图和反流数据报告。24小时多通道腔内阻抗-pH(MII-pH)监测结果判读：咽喉酸反流次数≥2次为咽喉反流阳性标准,DeMeester≥14.7分为胃食管反流阳性标准。3.免疫组化将石蜡切片进行脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭剂封闭、抗体孵育、DAB显色、复染、透明、封片等步骤进行,免疫组化的检测结果进行半定量判定。随机选取5个高倍视野,按鳞状上皮细胞或鳞状细胞癌细胞的胞浆显色深浅评分,无显色为阴性记0分,浅褐色为弱阳性记1分,棕褐色为阳性记2分,颗粒状深棕褐色为强阳性记3分；按显色组织的比例评分：显色<25%为1分,显色25%～50%为2分,显色51%～75%为3分,显色>75%为4分。根据二者的乘积将显色程度分为4级,0分为阴性记0级,1～4分为弱阳性记1级,5～8分为阳性记2级,9～12分为强阳性记3级。4.细胞培养人喉癌细胞株Hep-2,采用含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗RPMI 1640培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养。采用对数期生长的细胞用于实验。
参考文献
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[2]Role of reflux‐induced epithelial–mesenchymal transition in periprosthetic leakage after prosthetic voice rehabilitation[J].Kai J.Lorenz;;Klaus Kraft;;Franziska Graf;;Christian Pr?pper;;Konrad Steinestel.Head Neck,2015(4)
[3]Gastroesophageal reflux and carcinoma of larynx or pharynx:a meta-analysis[J].Duo Zhang;;Jian Zhou;;Bin Chen;;Liang Zhou;;Lei Tao.Acta Oto-Laryngologica,2014(10)
[4]Inflammasome:Cancer’s friend or foe?[J].Michela Terlizzi;;Vincenzo Casolaro;;Aldo Pinto;;Rosalinda Sorrentino.Pharmacology and Therapeutics,2014
[5]谭嘉杰.胃蛋白酶在喉癌中的表达及作用[D].南方医科大学,2016.