背景[1-3]
NPC1L1抗体也称为Niemann-Pick C1-Like 1抗体，是针对NPC1L1（Niemann-Pick disease,type C1,gene）-like 1）蛋白的特异性抗体。NPC1L1是一种在胆固醇代谢中起关键作用的膜蛋白，主要表达于小肠上皮细胞，参与胆固醇的吸收过程。NPC1L1抗体是用于科研和临床诊断中的一种特异性抗体，它主要用于检测和量化细胞表面蛋白NPC1L1的表达水平。NPC1L1蛋白在人体中扮演着重要的角色，特别是在胆固醇代谢和脂质运输过程中。在某些疾病状态下，例如尼曼-皮克病（Niemann-Pick disease）类型C，NPC1L1的功能丧失会导致脂质积累，从而引发一系列健康问题。
NPC1L1抗体
一、基本信息
英文名：NPC1L1 Antibody
靶标：NPC1L1蛋白
宿主：多为Rabbit（兔），也有其他来源如小鼠等
克隆性：分为多克隆（Polyclonal）和单克隆（Monoclonal）两种
形态：通常为冻干粉（Lyophilized）或液体（Liquid）形态
保存条件：一般推荐在-20℃或更低温度下保存，避免反复冻融
二、应用范围
NPC1L1抗体广泛应用于生物学研究和临床诊断中，包括但不限于：
Western Blot(WB)：用于检测细胞或组织样本中NPC1L1蛋白的表达水平
Immunoprecipitation(IP)：结合其他试剂进行免疫沉淀，用于纯化NPC1L1蛋白或研究其与其他蛋白的相互作用
Immunofluorescence(IF)：在细胞中定位NPC1L1蛋白的分布
ELISA：定量检测血清或其他生物液体中NPC1L1蛋白或其相关分子的浓度
三、抗体特性
免疫原：通常为NPC1L1蛋白或其特定片段的合成肽段
特异性：高度特异性地识别NPC1L1蛋白，减少非特异性结合
纯度：经过多种纯化步骤，如亲和纯化等，以提高抗体的纯度
四、供应商与价格
NPC1L1抗体由多家供应商提供，如Abnova、Covalab、immunoclone、ABCAM、BD、SANTA等。不同供应商提供的抗体在规格、价格、纯度等方面可能存在差异。例如，Abnova提供的Npc1l1多克隆抗体产品货号为PAB12092，价格需询价，而Covalab提供的抗体则针对NPC1L1的不同区域。价格范围从几千元到上万元不等，具体价格需根据供应商和购买数量等因素确定。
五、注意事项
在使用NPC1L1抗体前，请仔细阅读产品说明书，了解抗体的具体信息、推荐稀释比和实验方法。
不同批次和来源的抗体可能存在差异，建议在使用前进行预实验以确定最佳实验条件。
抗体保存时应避免反复冻融，分装可以最大限度减少冻融对抗体造成的损坏。
应用实例[4][5]
NPC1L1抗体可以用于利用CRISPR/Cas9技术体内示踪肠道胆固醇吸收中的NPC1L1内吞囊泡
哺乳动物细胞胞外游离胆固醇的吸收主要是由尼曼匹克C1型样蛋白1(Niemann–Pick type C1Like 1,NPC1L1)介导的囊泡内吞途径实现的。然而对NPC1L1介导胆固醇吸收的分子机制及其调节因素的认识还很有限。为可视化示踪肠道内源性NPC1L1介导的胆固醇吸收过程,本课题利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,将多肽标签FLAG和增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)引入到内源性NPC1L1蛋白的C端,构建NPC1L1-FLAG-EGFP(NPC1L1-FG)小鼠,利用NPC1L1抗体等技术检测分析NPC1L1-FG蛋白在小鼠不同组织中的表达特征,以明确改造后的内源性NPC1L1蛋白的表达分布规律;分析NPC1L1-FG小鼠全身的脂代谢表型,以明确经改造后的NPC1L1-FG蛋白是否影响胆固醇吸收及其代谢稳态。在上述功能学验证的基础上,利用该小鼠模型示踪分析肠道胆固醇吸收过程中的NPC1L1内吞囊泡形成的时效和量效关系,以及胆固醇吸收抑制药物依泽替米贝对NPC1L1-胆固醇内吞囊泡形成的抑制作用。
方法:1.制备Cas9/单向导RNA(Single-guide RNA,sg RNA)质粒:利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,针对小鼠NPC1L1基因的3’末端非编码区,设计不同sg RNA,利用细胞内的荧光素酶法,检测分析其Cas 9/sg RNA核酸酶活性,筛选出高活性的sg RNA序列,经体外转录制备sg RNA和Cas9 m RNA。2.构建打靶载体:PCR扩增小鼠NPC1L1基因靶点的两侧同源臂,长度均约为1.5 kb,与FLAG-EGFP编码的c DNA一起克隆至打靶载体。3.经酶切和测序鉴定正确的打靶载体DNA与sg RNA、Cas9 m RNA一起显微注射入小鼠受精卵,移植至假孕小鼠体内自然发育,生成NPC1L1-FG敲入小鼠。4.小鼠基因型鉴定:通过基因组DNA的PCR和Southern blot分析,筛选、鉴定重组正确且无随机插入的子代小鼠。5.荧光显微镜可视化观察和NPC1L1抗体Western blot检测NPC1L1-FG蛋白在敲入小鼠各组织中的表达谱。6.基本代谢水平检测:在高胆固醇饮食(HCD)喂养条件下,检测野生型小鼠与NPC1L1-FG小鼠的体重、血糖、进食量、粪便量、血脂、肝脏以及小肠组织中的脂质水平有无差异。7.探究NPC1L1-FG小鼠在胆固醇诱导下小肠上皮细胞中形成的内吞囊泡数量的时效和量效关系。8.探究NPC1L1-FG小鼠在胆固醇诱导下小肠上皮细胞中形成的内吞囊泡数量能否被胆固醇吸收抑制剂依泽替米贝所抑制。
NPC1L1抗体结果:1.成功构建了Npc1l1基因敲入打靶载体,并且制备了Cas9 m RNA和高活性的sg RNA,利用CRISPR/Cas9技术获得了对内源性NPC1L1蛋白C端进行FLAG和EGFP双重标记的子代NPC1L1-FG小鼠。2.荧光显微镜下观察和NPC1L1抗体Western blot实验显示NPC1L1-FG融合蛋白特异性地表达在模型小鼠的小肠组织的绒毛上皮细胞的刷状缘,并以空回肠表达较为丰富。3.NPC1L1-FG的纯合子小鼠与野生型小鼠具有相似的基本代谢表型和全身脂质稳态。4.NPC1L1-FG纯合子小鼠经40mg/ml的胆固醇灌胃后5～60分钟,其空肠中段上皮细胞在15分钟时形成的NPC1L1-胆固醇内吞囊泡数量最多。5.NPC1L1-FG纯合子小鼠灌胃以0～40mg/ml的胆固醇15分钟后,其空肠中段上皮细胞内NPC1L1-胆固醇内吞囊泡的形成具有剂量依赖性,20mg/ml时囊泡数量最多,40mg/ml时大囊泡的比例最高。6.依泽替米贝处理小鼠后,胆固醇诱导的小肠上皮细胞中内吞囊泡的数量有降低的趋势,但无统计学差异。
参考文献
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[2]Cryo-EM structures of NPC1L1 reveal mechanisms of cholesterol transport and ezetimibe inhibition.[J].Huang ChingShin;Yu Xinchao;Fordstrom Preston;Choi Kaylee;Chung Ben C;Roh SoungHun;Chiu Wah;Zhou Mingyue;Min Xiaoshan;Wang Zhulun.Science advances,2020
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[4]Stigmasterol stimulates transintestinal cholesterol excretion independent of liver X receptor activation in the small intestine[J].Hannah C.Lifsey;;Rupinder Kaur;;Bradley H Thompson;;Lisa Bennett;;Ryan E.Temel;;Gregory A.Graf.The Journal of Nutritional Biochemistry,2020
[5]武晓静.利用CRISPR/Cas9技术体内示踪肠道胆固醇吸收中的NPC1L1内吞囊泡[D].天津医科大学,2021.