背景[1-3]
LEC1仓鼠卵巢细胞源于从脯氨酸缺陷型的CHO克隆Pro-5中挑选出来的能抗麦芽凝集素的突变株。该细胞缺乏糖基转移酶GlcNAc-T1，导致N-连接碳水化合物被阻断在Man5-GlcNAC2-Asn中间体处，因此可用用于研究N-连接糖基化改变对内源糖蛋白的功能和分布的影响。Lec1细胞是脯氨酸营养缺陷型细胞，必须在含有脯氨酸(40 mg/L)的培养基中生长。
LEC1仓鼠卵巢细胞
LEC1仓鼠卵巢细胞细胞的复苏与培养操作步骤:
1.水浴锅37℃预热，并将完全培养基温浴到37℃。
2.在15 mL离心管中加入5 mL以上完全培养基备用。
3.从液氮或-80℃冰箱中取出细胞，放入37℃水浴锅中，快速晃动，使冻存液迅速融化。
4.用75%医用酒精擦拭冻存管外表面。
5.在超净台中打开冻存管，用巴氏吸管或移液枪吸取细胞冻存悬液，转移至先前准备的15 mL离心管中。
6.用1 mL完全培养基洗涤冻存管1次，收集残留细胞至上述15 mL离心管，减少损失。
7.细胞悬液以250×g离心4 min。
8.离心后去除上清。加入1 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。
9.将细胞平均接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中。加入足量完全培养基，1个T25培养瓶中培养基总量不少于5 mL。
10.放入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。
11.复苏次日，观察细胞状态，并更换新鲜的完全培养基或传代。
12.之后，每2-3天更换一次完全培养基，直到细胞生长至80%汇合，即需传代。
LEC1仓鼠卵巢细胞的传代操作步骤:
1.将完全培养基、0.25%Trypsin-EDTA（以下简称胰酶）预热至37℃。
2.吸去培养容器中的培养基。
3.用PBS(1X)（货号：MA0015）（T25培养瓶加入约3 mL，T75培养瓶加入约6 mL）洗涤细胞2次，注意动作轻柔，清洗全面。吸去PBS。
4.加入胰酶（T25培养瓶加入约0.5~1 mL，T75培养瓶加入约1~1.5 mL），迅速铺匀，保证充分接触细胞表面。
5.显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面。
6.立即加入完全培养基（T25培养瓶加入约1.5~3 mL，T75培养瓶加入约3~4.5 mL），随即轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。
7.使用吸管或移液管吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来。
8.将细胞悬液转移至离心管中。用PBS（T25培养瓶加入约3 mL，T75培养瓶加入约4 mL）洗涤容器1次，收集残留细胞。
9.收集的所有细胞悬液以250×g离心4 min。
10.离心后去除上清。加入1 mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。
11.将细胞按推荐传代比例（传第一代时可适当减少比例，如1:2~1:3）接种至适宜的培养容器内。
12.摇匀细胞，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中。
13.传代次日，观察细胞状态。培养期间可参考推荐换液频率进行换液。
14.待细胞生长至90%汇合，即需传代或冻存。
LEC1仓鼠卵巢细胞冻存操作步骤:
1.待细胞生长至可传代的密度，即可准备冻存。
2.细胞消化请参考细胞的传代操作步骤1~9。
3.离心后去除上清，用适量冻存液均匀重悬细胞。
4.将细胞按比例或数量分装至冻存管中。
5.若选用通用细胞冻存液，请在操作前将梯度降温盒放入4℃冰箱内预冷，细胞分装完后将冻存管放入梯度降温盒再放入-80℃冰箱中。
6.若选用无血清非程序细胞冻存液，请将冻存管直接分散放入-80℃冰箱中。
7.8 h后即可将细胞转移入液氮长期保存
应用[4][5]
LEC1仓鼠卵巢细胞可以用于灵芝孢子粉提取物对中国仓鼠卵巢细胞生长的影响及无血清生长因子筛选方法的构建
采用MTT法快速检测细胞增殖,筛选最佳Gls提取物浓度并替代部分血清,用于评估Gls提取物对CHO细胞生长的作用效果。通过LEC1仓鼠卵巢细胞构建稳定表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)细胞株,并在旋转瓶中进行动态培养,考察Gls在促进细胞增殖的同时对蛋白表达量的影响。此外利用这种一种非侵入式的血清类似物高通量筛选平台,筛选了三种促进细胞生长的血清类似物生长因子,同时通过多种细胞系验证发现由大豆蛋白胨(soya peptone),维生素C(vitamin C,Vc)和还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)组成的培养基,简称SVG培养基是一种广谱培养基。当Gls添加浓度为0.01%(w/v)时,CHO细胞在低血清(1%FBS)培养基中能够达到与正常培养基(10%FBS)一致的培养效果;同时通过血清饥饿诱导凋亡研究发现,Gls能够抑制血清饥饿诱导的细胞凋亡。
此外发现Gls中主要成分β-D-葡聚糖多糖对细胞增殖的影响与Gls提取物增殖促进效果一致。最后,通过旋转瓶扩增培养,CHO细胞在旋转瓶中动态培养60 h后,正常培养基中(10%FBS+DMEM)生长的CHO细胞扩增11.41倍,而1%FBS w 0.01%Gls培养基中生长的CHO细胞扩增倍数为10.29,与商业化的无血清(Serum Free,SF)培养基对照组扩增6.19倍相比,扩增倍数提高了66.38%。含有1%FBS的低血清培养基中加入适量Gls,与10%FBS普通培养基相比,CHO细胞的生长情况、细胞增殖数目、比生长速率和蛋白表达量几乎一致。
建立了一种光学分析检测LEC1仓鼠卵巢细胞增殖的方法,主要包括四个步骤:(1)转化pEGFP-N2到大肠杆菌DH5α中及提取无内毒素的质粒;(2)采用脂质体法瞬时转染pEGFP-N2到CHO细胞中;(3)采用遗传霉素G418对转染的细胞进行抗性筛选;(4)将稳定表达GFP的细胞株扩增培养,消化细胞并采用台盼蓝染色对细胞计数及采用酶标仪检测荧光强度,基于细胞内GFP荧光强度和细胞数目呈现线性关系,判断CHO细胞增殖情况,用于无血清培养基生长因子的高通量筛选,该方法具有易操作性、检测结果准确性、良好重复性、敏感度高和无毒等优势。
参考文献
[1]Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence(TIRF)microscopy[J].Peter Lanzerstorfer;;Verena Stadlbauer;;Lilia A Chtcheglova;;Renate Haselgrübler;;Daniela Borgmann;;Jürgen Wruss;;Peter Hinterdorfer;;Klaus Schr?der;;Stephan M Winkler;;Otmar H?glinger;;Julian Weghuber.Br J Pharmacol,2014(23)
[2]Effect of Brazilian propolis(AF-08)on genotoxicity,cytotoxicity and clonogenic death of Chinese hamster ovary(CHO-K1)cells irradiated with 60 Co gamma-radiation[J].Geyza Spigoti Santos;;Shigetoshi Tsutsumi;;Daniel Perez Vieira;;Paolo Bartolini;;Kayo Okazaki.Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis.2014
[3]Cell-based high-throughput proliferation and cytotoxicity assays for screening traditional Chinese herbal medicines[J].Ding Li;;Ru Zang;;Shang-Tian Yang;;Jufang Wang;;Xiaoning Wang.Process Biochemistry.2013
[4]Cell‐based screening of traditional chinese medicines for proliferation enhancers of mouse embryonic stem cells[J].Ding Li;;Sarah Isherwood;;Andrew Motz;;Ru Zang;;Shang‐Tian Yang;;Jufang Wang;;Xiaoning Wang.Biotechnol Progress,2013(3)
[5]钟启.灵芝孢子粉提取物对中国仓鼠卵巢细胞生长的影响及无血清生长因子筛选方法的构建[D].华南理工大学,2015.