背景[1-6]
人细胞自噬PCR芯片运用高通量荧光定量PCR方法，在一张96孔或384孔板上同时对某个信号通路或疾病相关基因的表达量变化进行检测，芯片上的基因包括了与研究对象有确定关系的基因或者待考证的基因；目前针对不同的信号通路和疾病相关基因设计了150多款功能分类PCR芯片，涵盖生命科学研究的各个领域。
人细胞自噬PCR芯片可用于研究参与自噬反应的84个关键基因的表达。自噬是一种细胞内的代谢过程，是通过溶酶体吞噬细胞中的受损蛋白和细胞器的过程。自噬作用已经被证明与很多正常的生理过程有关，如能量代谢、细胞器翻转、生长调节和老化。自噬受损将会导致心肌疾病和癌症等。该一芯片包含了与细胞内外信号通路有关的自噬的分子基因，及其关键调控因子基因。通过实时定量PCR的方法，研究者即能够利用该芯片简单可靠地同时检测自噬相关基因的表达。
细胞自噬(autophagy or autophagocytosis)：又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因(autophagyrelated gene，Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。目前发现自噬在重要的生物过程中，如细胞生长、细胞分化、天然和适应性免疫、老化和细胞死亡等都发挥着很重要的作用。
人细胞自噬ARRAY含有84个与人细胞自噬相关的基因，包括形成自噬组件和自噬调节因子两大部分，其中形成自噬组件的有：参与自噬性空泡形成的基因，负责蛋白质靶向膜/真空的基因，负责蛋白质转运的基因，将自噬体与溶酶体连接的基因，参与蛋白质泛素化的基因和具有蛋白酶活性的基因；参与自噬调节的基因有：自噬和细胞凋亡的共调节因子，自噬和细胞周期的共调节因子，细胞内病原体自噬诱导，响应于其他细胞内信号的自噬和伴侣介导的自噬。
应用[7][8]
人细胞自噬PCR芯片可用于细胞自噬信号通路研究：
在ATF6在内质网应激引起的HepG2细胞自噬与凋亡中作用机制的研究中活化转录因子6(Activating Transcription Factor6,ATF6)为内质网上的一种感受蛋白,是内质网应激引起的细胞凋亡和自噬途径中的一个重要的调节因子。尽管随着研究的深入对其调控机制已经取得了一些进展,但其在内质网应激引起的凋亡和自噬中的具体调控机制尤其是肿瘤细胞中的作用机制还不是很清楚。
因此,本研究以人肝癌HepG2细胞为研究对象,在内质网应激条件下,探讨ATF6在细胞凋亡和自噬中的作用以及由其介导的信号传导途径,为进一步阐明ATF6在凋亡与自噬中的作用机制提供实验依据。同时,为肿瘤治疗研究提供新的作用靶点。应用QRT-PCR和Western blot方法对与凋亡和自噬有关的mRNA和蛋白水平进行检测,验证iTRAQ筛选差异蛋白结果；并分别用Blebbistatin、SB203580和Dynasore作为MYH9、HSPB1和DynaminⅡ的抑制剂,Western blot检测自噬和凋亡相关蛋白的变化。
iTRAQ数据显示,共筛选到差异蛋白106个,其中有52种蛋白表达上调,54种蛋白表达下调。生物信息学分析表明,在这些差异蛋白中有许多与肿瘤的发生、发展有关；其中有24种蛋白与凋亡和自噬有关。验证实验表明,我们所挑选的基因和蛋白的变化趋势与iTRAQ结果中差异蛋白的变化趋势基本相一致。应用Blebbistatin和Dynasore并联合ATF6高表达后,凋亡相关蛋白Bcl-2的表达均升高,Bax表达量则显著下降；自噬相关蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表达量显著降低,p62的表达量则上升。
应用SB203580并联合ATF6高表达后,Bcl-2、LC3Ⅱ和Beclinl的表达量明显下降,Bax和p62的表达量则显著上升。以上结果表明,在内质网应激条件下,MYH9、HSPB1和DynaminⅡ三个蛋白可能参与了ATF6介导的细胞凋亡和自噬过程。
综上所述,内质网应激可以诱导人肝癌HepG2细胞发生细胞凋亡和自噬。ATF6能够促进内质网应激引起的凋亡和自噬,其调控凋亡的作用机制与线粒体途径有关,而DAPK1-Beclinl这一通路的激活参与了其调控自噬的过程。MYH9、HSPB1和DynaminⅡ三个蛋白均在ATF6介导的细胞凋亡和自噬过程中发挥了重要的作用,可作为研究ATF6调节凋亡和自噬作用机制的分子靶点。
参考文献
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[8]王丛丛.ATF6在内质网应激引起的HepG2细胞自噬与凋亡中作用机制的研究[D].中国农业大学,2014.