背景[1-6]
MMQ大鼠垂体瘤细胞源自大鼠垂体瘤，分泌泌乳素；表达功能性多巴胺受体。该细胞在免疫抑制的小鼠中不能成瘤，但在半固体培养基中可形成克隆。种属来源:大鼠；组织来源: 垂体；疾病特征: 垂体瘤；细胞形态: 上皮细胞样；生长特性: 悬浮生长；培养基: F12:Ham＇s F12 Nutrient Mixture 2.5%FBS+15%HS；生长条件: 气相：空气，95%；二氧化碳，5%;温度：37℃,传代方法: 1：2至1：6，每周2次；冻存条件: 90%完全培养基+10%DMSO，液氮储存。
MMQ大鼠垂体瘤细胞培养操作：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[7][8]
MMQ大鼠垂体瘤细胞可用于大鼠垂体瘤细胞增殖与凋亡水平的研究：
Pei等在垂体肿瘤细胞中检测到一个长约13 kb的mRNA呈高表达,而在正常垂体细胞中则无表达。体外研究显示,将转染PTTG的成纤维细胞种植于无胸腺裸鼠皮下,3周后形成肿瘤,故将这一基因定名为垂体瘤转化基因。研究发现,PTTG不仅表达于垂体瘤细胞,而且在细胞增殖活性高的正常组织有PTTG的高表达,如睾丸、胸腺和胚胎肝。
在正常结肠、肝脏、卵巢、垂体、胰腺、大脑、肾脏、末梢血白细胞等,PTTG只有弱表达甚至检测不到,但在所有被研究的肿瘤细胞(垂体肿瘤、结肠癌、肝癌、卵巢肿瘤、子宫肿瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肾癌、白血病等)和肿瘤细胞系(淋巴细胞系、骨髓细胞系、间充质细胞系、上皮细胞系等)中都有高表达。Zhang等用RT-PCR等方法检测54例脑垂体肿瘤及其正常脑垂体组织后发现,有46例脑垂体肿瘤PTTG mRNA含量高于对照组50%,其中23例分泌期型脑垂体肿瘤中,浸润至蝶骨的肿瘤PTTGmRNA表达明显高于病变局限在垂体窝的肿瘤。
目前,对于PTTG的研究表明,该基因广泛参与了垂体瘤的发生发展的整个过程,对于垂体瘤的生成起到了关键作用。RNA干扰技术是目前新兴且日益成熟的的基因沉默技术,目前已被认为是基因工程学领域的非常有效率的研究工具。用此技术可以高效稳定特异地阻止目标基因的表达,从而达到较为理想的沉默效果。目前,dsRNA,特别是siRNA已被广泛而成功地应用于诸如基因功能研究以及疾病病因与治疗研究等多个领域。
在针对原癌基因设计的基因治疗策略中,RNAi基因抑制效果确切,应用微量的siRNA即可使其编码致病基因产物的含量下降90%以上,甚至可以达到基因敲除的效果其次,RNAi的抑制具有严格的序列特异性,治疗的针对性强,应用此技术能够同时抑制多个不同基因而不致相互干扰;RNAi的作用具有级联式放大效应和高穿透性,更适合恶性肿瘤的实验研究,RNAi技术在肿瘤的基因治疗上具有光明的应用前景。对多种肿瘤细胞系的研究也证实:肿瘤细胞中均存在着RNAi的机制,化学合成、质粒/病毒或其他方式介导的RNAi可以有效的抑制内源性RNA的表达。
参考文献
[1]Pituitary Tumor Transforming Gene(PTTG)Stimulates Thyroid Cell Proliferation via a Vascular Endothelial Growth Factor/Kinase Insert Domain Receptor/Inhibitor of DNA Binding-3 Autocrine Pathway[J].D S.Kim,J A.Franklyn,K Boelaert,M C.Eggo,J C.Watkinson,C J.McCabe.The Journal of Clinical Endocrinology&Metabolism.2006(11)
[2]PTTG overexpression is correlated with angiogenesis in human pituitary adenomas[J].Takeo Minematsu,Masanori Suzuki,Naoko Sanno,Susumu Takekoshi,Akira Teramoto,R.Yoshiyuki Osamura.Endocrine Pathology.2006(2)
[3]RNA silencing and genome regulation[J].Ricardo Almeida,Robin C.Allshire.Trends in Cell Biology.2005(5)
[4]Development of gene-specific double-stranded RNA drugs[J].Sailen Barik.Annals of Medicine.2004(7)
[5]Cancer cells as targets for lentivirus-mediated gene transfer and genetherapy[J].Riikka Pellinen,Tanja Hakkarainen,Tiina Wahlfors,Kirsi Tulim?ki,Anna Ketola,Anni Tenhunen,Tuula Salonen,Jarmo Wahlfors.International Journal of Oncology.2004(6)
[6]Inhibitory effects of anti-sense PTTG on malignant phenotype of human ovarian carcinoma cell line SK-OV-3[J].Chen Gang,Li Jing,Li Fujun,Li Xiao,Zhou Jianfeng,Lu Yunping,Ma Ding.Journal of Huazhong University of Science and Technology[Medical Sciences].2004(4)
[7]Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex[J].Cell.2003(2)
[8]牟成志.RNA干扰沉默PTTG基因对大鼠垂体瘤细胞增殖与凋亡水平的影响[D].山东大学,2008.