背景[1-6]
小鼠角膜内皮细胞分离自眼角膜组织；角膜位于眼球前壁的一层透明膜，约占纤维膜的前1/6，从后面看角膜呈正圆形，从前面看为横椭圆形。角膜厚度各部分不尽相同，中央部最薄。角膜有十分敏感的神经末梢，如有外物接触角膜，眼睑便会不由自主地合上以保护眼睛。为了保持透明，角膜并没有血管，透过外界空气、泪液及房水获取养份及氧气。
角膜分为五层，由前向后依次为：上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层、内皮细胞层。角膜的高度透明性和光学性是正常发挥生理功能的必要条件之一，而角膜内皮细胞(CEC)在维持角膜的正常生理功能方面起重要作用。角膜内皮细胞是角膜内层的单层细胞，构成了后弹力层和房水之间的物理屏障，通过离子“泵”功能调节角膜中离子浓度和水分，维持角膜的半脱水状态，保证角膜的正常厚度和透明度。
一旦角膜内皮细胞功能出现紊乱，常导致角膜水肿而使角膜部分甚至完全失去透明性。角膜内皮细胞主要功能有：①角膜是唯一的无血管的组织，具有透明的特性和合成许多蛋白的功能；②角膜内皮细胞对角膜透明性有重要作用；③角膜内皮细胞通过Na+-K+-ATP酶活性，维持角膜和房水内Na+梯度，防止水分渗入角膜内，维持角膜实质层相对脱水状态，维持透明性。
小鼠角膜内皮细胞细胞传代：
1.吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；
2.添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余胰蛋白酶消化液，37℃温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5ml完全培养基终止消化；
3.用吸管轻轻吹打混匀，按1:2-1:3适当的比例进行接种传代，然后补充新鲜的完全培养基至5mL，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；
4待细胞完全贴壁后，培养观察；之后每隔2-3天更换新鲜的完全培养基。
注意事项：
1.培养基于4℃条件下可保存3-6个月。
2.在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。
3.传代培养过程中，胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。
4.建议客户收到细胞后前3天每个倍数各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和技术部沟通；由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，详尽告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪、回访直至问题得到解决。
应用[7][8]
小鼠角膜内皮细胞可用于胚胎干细胞来源的角膜缘上皮样细胞及角膜内皮样细胞构建组织工程全厚角膜的研究：
角膜所包含的细胞类型相对较少,主要有内皮细胞、上皮细胞和角膜基质细胞。相对于其他器官来说,构建TECs角膜更简单、易行。TECs的两个关键成分是种子细胞以及其支架材料。脱细胞小鼠角膜基质(Acellular porcine cornea matrix,APCM)具有正常角膜的关键特性,如良好的透明性和生物相容性、与天然角膜相似的力学特性、低免疫原性、可耐受手术缝合等。对于TECs的构建来说,其是一种良好的支架材料。
此外,小鼠角膜来源非常广泛。所以,在本研究中拟选用已经脱除了细胞的角膜基质(脱细胞小鼠角膜基质(Porcine cornea matrix,PCM)作为组织工程全厚角膜的支架。以往文献报道APCM在基质囊袋植入术后可维持一年不降解,且角膜基质细胞在移植术后3周可迁入其内。鉴于此,角膜基质细胞在组织工程全厚角膜构建中未接种。但小鼠角膜的厚度大于人角膜,经脱细胞程序后,其厚度进一步增加,而植片与植床厚度不匹配可影响角膜移植术后切口的愈合。
因此,在以脱细胞猪角膜为支架的组织工程全厚角膜的构建中,如何制备与天然角膜厚度相似的脱细胞猪角膜片层是首先需要解决的问题。种子细胞作为构建TECs中的又一关键成分,需要具备来源广泛、可在体外大量扩增等特点。但原代培养的人角膜上皮和内皮细胞增殖能力有限,而经基因转染的角膜细胞系具有潜在的致瘤性,限制了其临床应用。胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)因具有强大的增殖能力和分化全能性,可向机体三个胚层的细胞分化,近年来成为组织工程中种子细胞的一个重要的来源。
在我们前期研究中已建立了人胚胎干细胞在体外向角膜缘上皮样细胞和角膜内皮样细胞的诱导分化的方法。诱导的角膜缘上皮样细胞和角膜内皮样细胞与原代培养的细胞具有相似的形态和功能,可作为TECs的种子细胞的来源。角膜的上皮细胞和内皮细胞分别位于角膜前后两面。因此,为了模拟正常角膜结构,建立一个可于支架前后两面同时培养细胞的三维培养方案也是函待解决的问题。
参考文献
[1]Human embryonic stem cells[J].Pauliina Damdimopoulou,Sergey Rodin,Sonya Stenfelt,Liselotte Antonsson,Karl Tryggvason,Outi Hovatta.Best Practice&Research Clinical Obstetrics&Gy.2016
[2]The Boston Keratoprosthesis type 1 as primary penetrating corneal procedure[J].Fadous Raphaelle,Levallois-Gignac Samuel,Vaillancourt Louis,Robert Marie-Claude,Harissi-Dagher Mona.British Journal of Ophthalmology.2015(12)
[3]Progress in corneal wound healing[J].Alexander V.Ljubimov,Mehrnoosh Saghizadeh.Progress in Retinal and Eye Research.2015
[4]Differentiation of Stem Cells From Human Exfoliated Deciduous Teeth Toward a Phenotype of Corneal Epithelium In Vitro[J].Chia-Ling Tsai,Pei-Chin Chuang,Hsi-Kung Kuo,Yi-Hao Chen,Wen-Hong Su,Pei-Chang Wu.Cornea.2015(11)
[5]The structural and optical properties of type III human collagen biosynthetic corneal substitutes[J].Sally Hayes,Phillip Lewis,M.Mirazul Islam,James Doutch,Thomas Sorensen,Tomas White,May Griffith,Keith M.Meek.Acta Biomaterialia.2015
[6]Bioengineered multilayered human corneas from discarded human corneal tissue[J].Zhihua Zhang,Guoguang Niu,Jin San Choi,Matthew Giegengack,Anthony Atala,Shay Soker.Biomedical Materials.2015(3)
[7]Inducing pluripotency in vitro:recent advances and highlights in induced pluripotent stem cells generation and pluripotency reprogramming[J].I.K.Rony,A.Baten,J.A Bloomfield,M.E.Islam,M.M.Billah,K.D.Islam.Cell Prolif..2015(2)
[8]张灿伟.胚胎干细胞来源的角膜缘上皮样细胞及角膜内皮样细胞构建组织工程全厚角膜的研究[D].山东大学,2017.