背景[1-6]
NuPAGE Bis-Tris预制胶是进行高效凝胶电泳分离的预制聚丙烯酰胺凝胶，可用于宽分子量范围的蛋白样本。NuPAGE Bis-Tris预制胶具有中性pH环境，可最小化发生蛋白修饰的概率，确保获得更为清晰的条带，避免产生常见的“笑脸”条带。Novex NativePAGE Bis-Tris凝胶系统是一种预制聚丙烯酰胺小型凝胶系统，可对非变性蛋白和蛋白复合物进行灵敏的高分辨率分析、分子量估计和纯度评估。该系统是由Schägger和von Jagow在蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN PAGE）技术的基础上开发而成，具有近中性的操作pH和去污剂兼容性，突破了传统非变性电泳的限制。在标准SDS-PAGE中，电荷转移分子是SDS。SDS可以使蛋白质变性并附着其上，让蛋白质带有负电荷；这样可以使蛋白质向正极迁移。SDS存在于上样缓冲液和电泳缓冲液中。在NativePAGE Bis-Tris预制胶中，考马斯亮蓝G-250附着在蛋白质上使其带有负电荷，同时保持蛋白质的天然状态，不会使其变性。G-250存在于阴极缓冲液中为凝胶提供持续的G-250供给，在上样前添加于含有非离子型表面活性剂的蛋白样本中。
PVDF是推荐的印迹膜，用于与NativePAGE凝胶进行免疫印迹。硝酸纤维素与吸附NativePAGE凝胶不兼容，因为硝化纤维素膜与考马斯G-250染料结合得非常紧密，与用于脱膜和固定蛋白质的含酒精溶液不相容。
应用[7][8]
NuPAGE Bis-Tris预制胶可用于免疫印迹、测序、质谱以及其他任何对蛋白完整性要求高的应用。
结核病(tuberculosis,TB)是结核分枝杆菌所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病。全球有1/3的人感染过结核(MTB),每年有800万新感染患者和300万患者死亡,表明TB仍是影响全球人类健康的一个严重传染病。然而目前结核的诊断技术不够理想,寻找快速、简便、灵敏度和特异度高的结核杆菌的检测方法,对结核病的预防和控制有着重大的意义。
表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)是近些年来建立的筛选血清标志蛋白的蛋白质组学研究方法,具有高通量及高灵敏度,目前已用于多种肿瘤标志物检测的研究。本研究前期工作已经从肺结核患者和正常人血清中筛选出6个最具有诊断意义的肺结核血清标志蛋白。利用这6个标志蛋白建立诊断模型,区分TB与正常对照的分类准确率98.33%,灵敏度96.67%,特异度100%,阳性预测值100%,阴性预测值96.77。
目的:
1、通过改进样品处理、电泳条件、染色方法等,提高小分子蛋白(<10kD)在一维SDS-PAGE上的分辨率,以达到质谱鉴定的要求。
2、应用1D-SDS-PAGE电泳、切胶酶解和高效液相色谱串联质谱等技术方法进一步分离、鉴定前期SELDI已筛选出来具有诊断价值的结核标志蛋白,并进行生物信息学分析。
方法:
1、分别应用等电点沉淀法、乙腈沉淀法、Albumin/IgG Removal试剂盒去除血清中的中高丰度蛋白,再分别进行电泳、蛋白浓度测定,观察白蛋白的去除情况和目的蛋白的保留情况。
2、分别比较SDS-PAGE、Tricine-SDS-PAGE、4%-12%Bis-tris NuPAGE三种一维凝胶电泳(1D-PAGE)体系对处理过的血清样品中小分子蛋白的分离效果,以及分离胶加入尿素、甘油,电压,染色方法等电泳条件的优化。
3、通过一维凝胶电泳发现、分离肺结核相关血清小分子标志蛋白,经切胶酶解和高效液相色谱串联质谱鉴定目标蛋白,并进行生物信息学分析。
结果:
1、三种方法比较,乙腈沉淀法能在去除血清95%左右的高中丰度蛋白的同时收获更多的15kD以下的小分子量蛋白;等电点沉淀法和Albumin/IgG Removal试剂盒法都能去除血清大部分高丰度蛋白,使部分小分子蛋白得以显现,后者能很特异地只去除占血清中蛋白总量75%以上的白蛋白和免疫球蛋白。
2.Tricine-SDS-PAGE能很好地分离血清中的小分子蛋白,20kD以下的蛋白条带清晰可见;分离胶中加入甘油或尿素能改善小分子蛋白的分离效果;银染的灵敏度远高于胶体考染和常规考染,但在本实验中并没有发现新的条带。
3、应用Tricine-SDS-PAGE电泳、切胶酶解和高效液相色谱串联质谱等技术鉴定出分子量为8778Da结核标志蛋白很可能为Apolipoprotein A-II,序列覆盖率为21%,有3个不重复的肽段得到鉴定,结果较为可靠。
4、生物信息学分析发现,载脂蛋白AⅡ是一个分泌蛋白,它的一条氨基酸链含有77个(或76个)氨基酸,MW=8707.9Da(或MW=8579.78),pI=5.05,可能与目的蛋白8778 Da的氨基酸序列相同。结核病的发生、发展与脂质代谢方式密切相关,ApoA-II又与脂质代谢密不可分,ApoA-II可能为结核比较特异的标志物。
参考文献
[1]Tuberculosis in Africa:Learning from Pathogenesis for Biomarker Identification[J].Stefan H.E.Kaufmann,Shreemanta K.Parida.Cell Host&Microbe.2008(3)
[2]Lipolytic enzymes in Mycobacterium tuberculosis[J].Applied Microbiology and Biotechnology.2008(5)
[3]Identification of diagnostic markers for tuberculosis by proteomic fingerprinting of serum[J].Dan Agranoff,Delmiro Fernandez-Reyes,Marios C Papadopoulos,Sergio A Rojas,Mark Herbster,Alison Loosemore,Edward Tarelli,Jo Sheldon,Achim Schwenk,Richard Pollok,Charlotte FJ Rayner,Sanjeev Krishna.The Lancet.2006(9540)
[4]Cholesterol-sensor initiates M.tuberculosis entry into human macrophages[J].D.Kaul,P.K.Anand,I.Verma.Molecular and Cellular Biochemistry.2004(1)
[5]Free flow electrophoresis coupled with liquid chromatography–mass spectrometry for a proteomic study of the human cell line(K562/CR3)[J].Yonghui Wang,William S.Hancock,Gerhard Weber,Christoph Eckerskorn,Darryl Palmer-Toy.Journal of Chromatography A.2004(1)
[6]Molecular mechanisms regulating persistent Mycobacterium tuberculosis infection[J].Thomas C Zahrt.Microbes and Infection.2003(2)
[7]FindPept,a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification[J].AlexandreGattiker,Willy V.Bienvenut,AmosBairoch,ElisabethGasteiger.Proteomics.2002(10)
[8]胡天桥.肺结核患者血清小分子标志蛋白分离鉴定的初步研究[D].广西医科大学,2009.