背景[1-6]
Novex 10-20%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format,12-well是浓度10-20%12孔聚丙烯酰胺凝胶，可将各种蛋白质重复分离成具有两倍负载能力的良好分辨的条带。Novex Tris-Glycine Mini Gels基于传统的Laemmli蛋白电泳，可以使用Laemmli样品和运行缓冲液。
Novex Tris-甘氨酸凝胶的特性包括：
•改善保质期-在4°C下长达6个月的储存凝胶
•多样性-用于原生和变性蛋白质分析
•楔形孔-轻松加载多达两倍的样品量
•快速运行条件-在不到60分钟内使用恒定电压快速分离蛋白质
Novex 10-20%Tris-Glycine Mini Gels不含SDS，可用于以天然或变性形式运行蛋白质。对于变性蛋白质，建议使用Novex Tris-Glycine SDS样品缓冲液和Novex Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液。对于天然蛋白质，我们建议使用Novex Tris-Glycine Native Sample Buffer和Novex Tris-Glycine Native Running Buffer。
特性[1]
Novex Tris-Glycine凝胶，WedgeWell格式，具有创新的楔形孔，其样品负载量比其他1.0 mm厚的凝胶多两倍。楔形井也有较大的开口，使样品装载更容易。
为了将蛋白质转移到膜上，建议在使用Invitrogen Mini Blot模块进行传统湿转移时使用Novex Tris-Glycine Transfer Buffer。也可以使用快速半干转移进行转移使用iBlot 2凝胶转移装置进行Invitrogen Power Blotter或快速干转移。
应用[7][8]
用于Fbxw7通过泛素化蛋白酶解YAP诱导肝癌细胞凋亡和生长停滞研究。
原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,病死率在各种癌症病死率中居第2位,其中肝细胞癌占PLC的90%以上。HCC发病率逐年升高,随着高危人群筛查、肝移植技术的成熟、影像学早期诊断以及经动脉化疗栓塞、射频消融(Radiofrequency ablation,RFA)和索拉菲尼(Sorafenib)等辅助治疗的临床应用,HCC患者的预后较前已经有了明显的改善,但总体上还未取得令人满意的疗效。分子靶向药物索拉菲尼的临床应用弥补了晚期HCC患者治疗手段的空缺,因此,进一步明确HCC发生发展涉及的精确分子机制,探索HCC早期诊断分子标志物、设计有效的肿瘤治疗分子靶点以及患者预后指示标志物,对提高我国肝癌的治疗水平和改善肿瘤患者预后具有重要意义。
泛素介导的蛋白质降解通路是基因和蛋白质功能的主要调节者和终结者,控制着真核细胞内绝大多数蛋白质的降解,因此,对该通路的调控已成为疾病治疗中的一种创新性方法。F框/WD-40域蛋白7(F-box and WD repeat domain-containing 7,Fbxw7)是SCF(Skpl-Cullinl-F-box)类泛素连接酶E3复合体中特异性识别底物的关键因子,能够靶向泛素化降解CyclinE,c-Myc,c-Jun,Mcl-1(Myeloid cell leukemia-1)和Notch等癌蛋白,从而抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡并增加化疗敏感性。
研究表明Fbxw7在多种恶性肿瘤中表达缺失,其低表达与患者不良预后密切相关,是一种广泛的抑癌基因。p53在转录水平调节Fbxw7基因达,p53-/+Fbxw7-/+基因敲除小鼠和受辐射的Fbxw7-/+小鼠均自发产生包括HCC在内的多种肿瘤,提示Fbxw7与HCC的发生发展存在着某种联系。
Fbxw7的多个靶蛋白如CyclinE,c-Myc,c-Jun和Notch等在HCC中存在表达异常,且与HCC增殖、凋亡、耐药及不良预后密切相关。Hippo信号通路在哺乳动物中是一个高度保守有效的细胞生长和凋亡调控因子,在许多人类肿瘤特别是HCC中存在该通路的异常,而该通路的核心效应分子是Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)。在HCC和乳腺癌中YAP被鉴定为位于11q22扩增子的一个促癌基因,YAP转基因小鼠出现肝脏体积明显增大并最终产生肿瘤,临床研究发现YAP是一个与HCC患者无病生存期和总生存期相关的独立预测因素,提示Hippo-YAP信号通路在HCC发生发展中发挥着极其重要的作用。应用免疫组化染色、Western blot和qRT-PCR检测Fbxw7在HCC及对应癌旁组织中的表达,分析Fbxw7与HCC临床病理特征的相关性。
2.应用qRT-PCR鉴定Fbxw7 mRNA在永生化人肝细胞系L02和HCC细胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel-7402及Huh7的表达水平。
3.应用逆转录病毒介导的Flag-Fbxw7和Fbxw7-shRNA分别转染HepG2和Hep3B细胞,qRT-PCR和Western blot检测Fbxw7表达变化,流式细胞术、Caspase3/7活性分析、BrdU细胞增殖分析和MTT法检测细胞增殖和凋亡变化。
4.应用免疫组化染色检测YAP在HCC及对应癌旁组织中的表达,分析YAP与Fbxw7蛋白蛋白表达相关性。
参考文献
[1]Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer[J].Eva J.Vlug,Robert A.H.Ven,Jeroen F.Vermeulen,Peter Bult,Paul J.Diest,Patrick W.B.Derksen.Cellular Oncology.2013(5)
[2]Tau degradation:The ubiquitin–proteasome system versus the autophagy-lysosome system[J].Min Jae Lee,Jung Hoon Lee,David C.Rubinsztein.Progress in Neurobiology.2013
[3]Yes-Associated Protein Up-regulates Jagged-1 and Activates the NOTCH Pathway in Human Hepatocellular Carcinoma[J].Darjus Felix Tschaharganeh,Xin Chen,Philipp Latzko,Mona Malz,Matthias Martin Gaida,Klaus Felix,Sara Ladu,Stephan Singer,Federico Pinna,Norbert Gretz,Carsten Sticht,Maria Lauda Tomasi,Salvatore Delogu,Matthias Evert,Biao Fan,Silvia Ribback,Lijie Jiang,Stefania Brozzetti,Frank Bergmann,Frank Dombrowski,Peter Schirmacher,Diego Francesco Calvisi,Kai Breuhahn.Gastroenterology.2013(7)
[4]Effect of Mst1 overexpression on the growth of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and the sensitivity to cisplatin in vitro[J].Chuanming Xu,Chunju Liu,Wei Huang,Shuo Tu,Fusheng Wan.Acta Biochimica et Biophysica Sinica.2013(9)
[5]Hepatitis B virus X protein modulates oncogene yes‐associated protein by CREB to promote growth of hepatoma cells[J].Tao Zhang,Junping Zhang,Xiaona You,Qian Liu,Yumei Du,Yuen Gao,Changliang Shan,Guangyao Kong,Youliang Wang,Xiao Yang,Lihong Ye,Xiaodong Zhang.Hepatology.2012(6)
[6]Yes‐associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation[J].Haibo Bai,Nailing Zhang,Yang Xu,Qian Chen,Mehtab Khan,James J.Potter,Suresh K.Nayar,Toby Cornish,Gianfranco Alpini,Steven Bronk,Duojia Pan,Robert A.Anders.Hepatology.2012(3)
[7]Hepatocellular carcinoma[J].Alejandro Forner,Josep M Llovet,Jordi Bruix.The Lancet.2012(9822)
[8]涂康生. Fbxw7通过泛素化蛋白酶解YAP诱导肝癌细胞凋亡和生长停滞[D].西安交通大学,2017.