背景及概述[1][2]
手性胺在医药、农药和化学产业中起到非常重要的作用，它们通常作为中间体或合成单体用于制备各种诸如药物活性物质的生理活性物质，例如头孢菌素或吡咯烷衍生物等为数众多的手性胺的各种应用中，只有一种特定的光学活性形式，即（R）或（S）对映体是有生理活性的。
合成3,3,3-三氟丙胺类化合物的化学方法主要有采用三氟化试剂直接对胺类底物引入三氟基团。然而，三氟化试剂如C6H5SCF3等比较昂贵，且难以制备；而3,3,3-三氟丙胺底物不稳定、易分解，在反应过程中容易水解，所以上述化学合成方法，不适合放大实验和产业化。与传统的化学合成方法相比，酶法通常使用更为温和的条件，并且能够获得合理的立体选择性。但是，通常使用的酶底物特异性、对映体选择性和/或转化率对于工业化的生产过程还不够高。另外，使用转氨酶生产光学活性胺的一个最主要的缺陷是常常会发生底物和产物抑制现象。
根据PFAM 数据库中的多序列比对，3,3,3-三氟丙胺的转氨酶可以被分为5类：天冬氨酸转氨酶、芳香族转氨酶、ω-转氨酶、支链转氨酶和D-转氨酶。由于ω-转氨酶可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工业应用价值。
3,3,3-三氟丙胺
制备[2]
将带有重组质粒pET-28a-ω-opt-TA的重组工程菌接种到20 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180 rpm振荡过夜培养，然后以1%的接种量接种到含有50 μg/mL卡那霉素的100 mL LB液体培养基，37℃、180 rpm培养至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG（终浓度为1 mmol/L），25℃、150 rpm继续诱导18 h。诱导结束后，4 ℃下4000×g离心10 min，收集菌体沉淀。用pH 8.0、0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤两次，除尽培养基后再用原发酵液体积1/10的破胞缓冲液重悬细胞，在冰浴中超声破胞90次（300 W，工作3 s，间隙6 s），12000×g离心10 min收集上清，即得到含有转氨酶活性的粗酶液。
采用Ni-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。经上样、清洗和洗脱，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。Ni-NTA亲和层析过程中，细胞裂解缓冲液：50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠，300 mmol/L氯化钠，20 mmol/L咪唑，pH 8.0；洗脱缓冲液：50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠，300 mmol/L氯化钠，100 mmol/L咪唑，pH 8.0；再生缓冲液：50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠，300mmol/L氯化钠，250 mmol/L咪唑，pH 8.0。
Ni-NTA亲和层析后得到的ω-TA洗脱液经SDS-PAGE检测为电泳纯化，如图3所示，该酶液用20 mM pH8.0磷酸缓冲液4℃透析24小时，除去咪唑等小分子杂质，该重组酶于4℃冰箱保存。
以外消旋的三氟丙酮为底物，利用纯化的ω-TA酶为催化剂，于20～40℃、pH 6.5～8.5的缓冲体系中进行转化反应。例如，在2 mL的催化反应体系中，添加0.5 mg ω-TA、10 μmol三氟丙酮、30 μmol L-丙氨酸或L-天冬氨酸以及0~2 μmol PLP，在25 ℃反应0.5～3h，所得的产物用5mL 乙酸乙酯萃取，萃取液用于气相色谱分析底物的转化率。萃取液加入1 mL三乙胺后静置5 min，然后再加入1.2 mL乙酰氯反应10 min，所得的反应液用手性毛细管气相色谱法分析产物对映体过量值（ee）。
采用气相色谱法分析底物的转化率。所用气相色谱仪为福立GC-9790气相色谱仪，气相色谱柱为30 m×250 μm×0.25 μm KF-3，进样口和检测器温度分别为 180 ℃和200 ℃，FID检测器，载气（氮气）流速30 mL/min，氢气流速为30 mL/min，空气流速为300 mL/min。程序升温条件为50 ℃维持5 min，10 ℃/min升温至180 ℃，维持5min。
用手性毛细管气相色谱法分析产物对映体过量值（ee）。所用气相色谱仪为滕州经纬 GC8100，手性毛细管气相色谱柱为0.25 mm×25 m FS-LIPODEX-E，进样量为3 μL，进样口和检测器温度分别为180 ℃和200℃，载气（氮气）流速30 mL/min，氢气流速为30 mL/min，空气流速为300 mL/min。程序升温条件为100℃维持2 min，5℃/min升温至150℃，维持5min。
将带有重组质粒pET-28a-ω-opt-TA的重组工程菌接种到20 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180 rpm振荡过夜培养，然后以1%的接种量接种到含有50 μg/mL卡那霉素的100 mL LB液体培养基，37℃、180 rpm培养至OD600为0.6～0.8时，加入IPTG（终浓度为1 mmol/L），25℃、150 rpm继续诱导18 h。诱导结束后，4 ℃下4000×g离心10 min，收集菌体沉淀。用pH 8.0、0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤两次，除尽培养基后再用原发酵液体积1/10的破胞缓冲液重悬细胞，在冰浴中超声破胞90次（300 W，工作3 s，间隙6 s），12000×g离心10 min收集上清，即得到含有转氨酶活性的粗酶液。
采用Ni-NTA亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。经上样、清洗和洗脱，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。Ni-NTA亲和层析过程中，细胞裂解缓冲液：50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠，300 mmol/L氯化钠，20 mmol/L咪唑，pH 8.0；洗脱缓冲液：50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠，300 mmol/L氯化钠，100 mmol/L咪唑，pH 8.0；再生缓冲液：50 mmol/L磷酸二氢钠/磷酸氢二钠，300mmol/L氯化钠，250 mmol/L咪唑，pH 8.0。
Ni-NTA亲和层析后得到的ω-TA洗脱液经SDS-PAGE检测为电泳纯化，如图3所示，该酶液用20 mM pH8.0磷酸缓冲液4℃透析24小时，除去咪唑等小分子杂质，该重组酶于4℃冰箱保存。
以外消旋的三氟丙酮为底物，利用纯化的ω-TA酶为催化剂，于20～40℃、pH 6.5～8.5的缓冲体系中进行转化反应。例如，在2 mL的催化反应体系中，添加0.5 mg ω-TA、10 μmol三氟丙酮、30 μmol L-丙氨酸或L-天冬氨酸以及0~2 μmol PLP，在25 ℃反应0.5～3h，所得的产物用5mL 乙酸乙酯萃取，萃取液用于气相色谱分析底物的转化率。萃取液加入1 mL三乙胺后静置5 min，然后再加入1.2 mL乙酰氯反应10 min，所得的反应液用手性毛细管气相色谱法分析产物对映体过量值（ee）。
采用气相色谱法分析底物的转化率。所用气相色谱仪为福立GC-9790气相色谱仪，气相色谱柱为30 m×250 μm×0.25 μm KF-3，进样口和检测器温度分别为 180 ℃和200 ℃，FID检测器，载气（氮气）流速30 mL/min，氢气流速为30 mL/min，空气流速为300 mL/min。程序升温条件为50 ℃维持5 min，10 ℃/min升温至180 ℃，维持5min。
用手性毛细管气相色谱法分析产物对映体过量值（ee）。所用气相色谱仪为滕州经纬 GC8100，手性毛细管气相色谱柱为0.25 mm×25 m FS-LIPODEX-E，进样量为3 μL，进样口和检测器温度分别为180 ℃和200℃，载气（氮气）流速30 mL/min，氢气流速为30 mL/min，空气流速为300 mL/min。程序升温条件为100℃维持2 min，5℃/min升温至150℃，维持5min。
在2 mL的20 mM pH 8.0磷酸缓冲液中，添加0.25 mg ω-TA、5 μmol三氟丙酮、15 μmol L-天冬氨酸以及0.1 μmol PLP，在25 ℃反应1h，得到转化率为97.0%的3,3,3-三氟丙胺。
主要参考资料
[1] 梅苏宁, 杨建明, 薛云娜, 王伟, 王为强, & 吕剑. (2011). 含氟低级脂肪胺的合成及应用进展. 化工新型材料, 39(8), 19-22.
[2] 杨幼平, 陈小明, 王良芥, & 罗和安. (2004). 毛细管气相色谱法测定水溶液中n,n-二甲基-2,3-二氯丙胺盐酸盐. 分析仪器(1), 37-39.
[3] 田良鑫. (1999). 全氟化碳心停搏液的心肌保护作用. 岭南心血管病杂志(4), 295-296.