方法一、酶解-树脂法
酶解 取100kg新鲜肠黏膜(总固体5%-7%)，加苯酚200ml (0.2%)，如气温低时可不加。在搅拌下加入绞碎胰0.5-1kg(0.5%-1%)，用 300-400g/L(30%-40%)NaOH溶液调节pH8.5-9，升温至40-45℃，保温2-3h。pH8，再加5kg粗食盐(5%)升温至90℃左右，用6mol/L HCl调节pH 6.5左右，停止搅拌，保温20min，以布袋过滤，得酶解滤液。
肠黏膜[胰浆，NaOH]→[pH8.5-9, 40-45℃, 保温2-3h]肠黏膜液[NaCl, 6mol/L HCl]→[pH8; 90℃, pH6.5]滤液
吸附、洗涤、洗脱 取上述滤液冷至50℃以下，用6mol/L NaOH调节pH7，加入5kgD-254强碱性阴离子交换树脂，搅拌5h左右，交换完毕，弃去液体，用自来水漂洗树脂至水清，用与树脂等体积的2mol/L NaCl，搅拌洗涤15min，弃去洗涤液，再加2倍树脂体积的1.2mol/L NaCl洗涤2次。用约树脂体积一半的5mol/L NaCl洗脱1h，收集洗脱液，然后用约树脂体积的1/3的3mol/L NaCl洗脱2次，合并洗脱液。
滤液[D-254树脂, NaOH]→[pH7, 5h]吸附物[NaCl]→[2mol/L→1.2mol/L, →5mol/L, →3mol/L]洗脱液
沉淀、脱水、干燥 将洗脱液用滤纸浆助滤，过滤1次，澄清滤液以体积计加入用活性炭处理过的0.9倍的95%乙醇，冷处沉淀8-12h。虹吸上清液弃去，按100kg黏膜加300ml的比例向沉淀中补加蒸馏水，再加入4倍量95%乙醇，冷处放置6h，收集沉淀，用无水乙醇脱水1次，丙酮脱水2次，置P2O5干燥器中真空干燥，得肝素钠粗品。
洗脱液[95%乙醇]→[8-12h]沉淀物[无水乙醇；丙酮]→[P2O5]肝素钠粗品
脱色、沉淀、干燥 用20g/L(2%)氯化钠溶液配成100 g/L(10%)的肝素钠溶液，以40g/L(4%)高锰酸钾溶液进行氧化脱色，每亿单位估计加入0.65mol高锰酸钾。先将药液调至pH8，预热80℃，在搅拌下加入高锰酸钾，保温2.5h，以滑石粉作助滤剂，过滤，收集滤液。将滤液调节pH6.4，用0.9倍的95%乙醇置于冷处理沉淀6h以上，收集沉淀，溶于10 g/L(1%)氯化钠溶液中，用量按肝素钠粗品质量收率60%-70%计，配成50 g/L(5%)肝素钠溶液，再用4倍量的95%乙醇冷处放置6h以上，收集沉淀物，用无水乙醇、丙酮脱水，乙醚洗涤1次，置P2O5干燥器中干燥，得肝素钠精品。肠黏膜换算成总固体7%计，收率20000U/kg，最高效价141.6U/mg。
肝素钠粗品[20g/L NaCl]→肝素钠溶液[KMnO4]→[pH8, 80℃, 2.5h]滤液[95%乙醇]→[pH6.4, 6h]沉淀物[无水乙醇；丙酮；乙醚]→肝素钠精品
注射剂的制备 取肝素钠成品溶于一定量注射用水中，封口，灭菌，即得。
肝素钠精品[注射用水]→注射剂
方法二、盐解-树脂法
提取 取新鲜猪肠黏膜投入反应锅中，按30g/L(3%)加入氯化钠，NaOH调节pH9，逐步升温至50-55℃，保温2h，继续升温至95℃，维持10min，冷却50℃以下，用30目双层纱布过滤，收集滤液。
猪肠粘膜[NaCl; NaOH]→[pH9; 50-55℃]滤液
吸附、洗涤、洗脱、沉淀 取冷却50℃以下的滤液，加入714型(强碱性)Cl-型树脂(新树脂用量为2%)，搅拌8h后静置过夜。次日虹吸除去上层液，收集树脂，用水冲洗至洗液澄清，滤干，用2倍量1.4mol/L氯化钠搅拌2h，滤干；再用1倍量1.4mol/L氯化钠搅拌2h，滤干；继续改用2倍树脂量的3mol/L氯化钠搅拌洗脱8h，滤干；再用1倍量3mol/L氯化钠搅拌洗脱2h，滤干，合并滤液，加入等量95%乙醇沉淀，过夜，虹吸除去上清液，收集沉淀。丙酮脱水干燥，得粗品。
滤液[714型树脂]→吸附物[NaCl]→[1.4mol/L, 3mol/L]洗脱液[95%乙醇，丙酮]→粗品
溶解、脱色、沉淀、干燥 粗品溶于15倍10 g/L(1%)氯化钠溶液中，加入6mol/L盐酸调pH1.5左右，过滤至清，随即用5mol/L氢氧化钠调节pH11，按3%加入过氧化氢(浓度为30%)25℃放置。开始不断调整pH至11，第2天再按1%加入过氧化氢，调整pH11，继续放置，共48h。过滤，用6mol/L盐酸调节pH6.5，加入等量的95%乙醇沉淀。过夜。次日虹吸除去上清液，沉淀用丙酮洗涤脱水，干燥，即得肝素钠精品。总收率20000U/kg肠黏膜(按肠黏膜的固体量为5%-7%计算)。
粗品[1%NaCl, 6mol/L HCL]→[pH1.5]滤液[NaOH, H2O2]→[pH11, 25℃, 48h]滤液[6mol/L HCl, 95%乙醇]→[pH6.5, 24h]沉淀[丙酮]→肝素钠精品
方法三、CTAB*提取法(*十六烷基三甲基溴化胺为长链季铵盐)
提取、络合 按猪肠黏膜液(V)：Na2SO4(m)：硫酸铝(m)：CTAB(V)=1：0.15：0.04：0.001的配料比投料。取新鲜猪小肠黏膜投入反应罐中，搅拌下加入硫酸钠，溶解后，用碱液调节pH11-11.5，升温50℃，保温搅拌2h，再加硫酸铝，溶解后，用氢氧化钠调节pH7.5-8，升温至95℃，保温10min，趁热过滤，待滤液冷却至60℃以下时，缓缓加入CTAB和硅藻土，搅拌吸附1h，静置过夜，滤饼用40℃热蒸馏水洗至无色，抽干即得络合物。
猪肠黏膜液[Na2SO4，碱液， Al2(SO4)3]→[pH11-11.5, 50℃, 2h; pH7.5-8, 95℃, 10min]提取液[CTAB， 硅藻土]→[60℃以下，1h]滤饼[蒸馏水]→[40℃]络合物
解离、沉淀 取络合物溶于适量氯化钠溶液中，以冰醋酸调pH4，升温60℃，保温30min，静置过夜。次日吸取上清液，离心，收集清液，加入95%乙醇沉淀，再放置过夜，沉淀用丙酮洗涤，干燥即得肝素钠粗品。
络合物[NaCl, 冰醋酸]→[pH4, 60℃, 30min]滤液[95%乙醇，丙酮]→粗品
脱色、沉淀、去钾离子、干燥 将粗品用25倍新鲜配制的氯化钠溶液溶解，用氢氧化钠溶液调pH8，升温80℃后，加入适量的KMnO4溶液脱色，至颜色不退为止。过滤，滤液冷却后，加0.9倍95%乙醇沉淀，静置过夜。离心，沉淀加蒸馏水溶解，加强酸性苯乙烯阳离子树脂001×8，搅拌30min，过滤，滤液加10g/L (1%)的氯化钠，调pH10.5-11，按体积再加1%过氧化氢溶液，保持25℃，静置2天。过滤，滤液加等量的95%乙醇沉淀，静置24h，沉淀用乙醇、丙酮洗涤，真空干燥或冰冻干燥即得肝素成品。按肠黏液计，收率11000-15000U/kg。
粗品[NaCl, NaOH, KMnO4]→[pH8, 80℃]脱色液[95%乙醇]→沉淀物[水，001×8树脂]→[30min]去钾离子液[10g/L NaCl, H2O2]→[pH10.5-11, 25℃, 48h]脱色液[95%乙醇]→[24h]沉淀物[乙醇、丙酮]→肝素成品
方法四、以牛肺为原料
原料处理 取冻牛肺融化后，剪去主气管和较大气管，然后剪成长条，置绞碎机中用3mm绞板绞碎成肉糜状，所得净肺糜量为毛肺的70%-80%。
牛肺→[融化，绞碎]牛肺浆
自溶、提取、沉淀 取牛肺糜300kg，加水150g，搅拌均匀，加温45℃，加入甲苯6L，在39-41℃保温自溶20h，每半小时搅拌1次。再取27kg硫酸铵溶于90kg水中，加入自溶液中，用400g/L(40%)NaOH溶液调节pH8.8-9.2，水浴加温至50℃，保温搅拌1h，继续加热，在3h内升温至90℃，保温20min，冷却至50℃以下，布袋过滤，滤渣压滤，滤饼加100kg水和硫酸铵6kg再提取1次，弃去滤渣，合并2次提取液，约得提取液1.5-1.6kg/kg净肺重。将提取液用20%H2SO4调节pH2.5，放置过夜。沉淀肝素·蛋白络合物，虹吸弃去上清液，绸布过滤，沉淀用5倍量乙醇搅拌浸泡1h，过滤，滤渣再用5倍量乙醇搅拌洗涤2次，除去脂肪，滤干，得粗制湿品，收率1.2%-1.4%。
牛肺浆[自来水，甲苯]→[39-41℃, 20h]自溶液[(NH4)2SO4, 水，NaOH]→[pH8.8-9.2, 50℃, 1h]自溶液[90℃，20min]→提取液[H2SO4]→[pH2.5, 24h]肝素·蛋白络合物[乙醇]→[1h]粗品
解离 将粗品加入5倍量水和少量400g/L(40%)NaOH，调pH9-10，球磨半小时，使之成糨糊状，继续加水至粗品量的20倍，滴加40%NaOH至全溶，最终pH10。加入NaCl达100 g/L(10%)，用20% H2SO4调pH2.5，静置过夜。吸取上清液，过滤，沉淀用2倍量的pH2.5、10%NaCl溶液洗涤1次，合并上层清液和洗涤液，得黄色透明肝素溶液。
粗品[水，NaOH]→[pH9-10]糊状物[水，NaOH]→[pH10]溶液[NaCl, H2SO4]→[pH2.5, 24h]肝素溶液
提纯、干燥 上述肝素溶液中加入等量水，用2mol/L NaOH液调pH7。按总体积计算称取溴化十五烷吡啶(PPB)25g，加水溶解成5%溶液，置分液漏斗中，用乙醚振摇3-4次，直至醚层完全无色为止，分出水层。在搅拌下将红色清液滴加于肝素溶液中，冰箱中静置过夜。收集沉淀，用蒸馏水洗涤2-3次，至洗液对1mol/L KSCN溶液无反应为止。沉淀用2mol/L NaCl溶液溶解，0.1mol/L NaOH溶液调pH7，2500r/min离心10min，去油状物，离心液布氏漏斗滤清，清液加入0.8倍量的丙酮，置冰箱中过夜。离心，收集沉淀，丙酮洗涤2-3次，置P2O5真空干燥器中干燥，得灰白色粉末肝素精品。按净肺质量计，收率0.11g/kg，效价90-100U/mg。
肝素溶液[水，NaOH, PPB]→[pH7]沉淀物[水，NaCl, NaOH]→[pH7]精品
脱色、除热原、干燥 将精品溶于15倍量的蒸馏水中，滴加1mol/L NaOH至pH8.5-9，滤去不溶物。按溶液体积以2%、0.5%、0.5%和1% 4次加入30% H2O2溶液，保持pH8.5-9，20h脱色完毕，过滤除去氧化物，得肝素脱色液。再滴加5mol/L NaOH溶液调节pH12-13，室温放置24h，按无热原操作法过滤，清液用5mol/L盐酸调pH7左右，再按溶液体积加入10g/L(1%)经250℃烘干1h的无热原NaCl，搅拌下加入0.8倍的丙酮，置冰箱4-5h，离心，收集沉淀。用50%丙酮洗涤2次，无水丙酮洗涤2次，乙醚洗涤1次，置P2O5真空干燥器中干燥，即得白色粉末状的肝素成品。按净肺质量计，收率9000 U/kg，效价130-140U/mg。
|