小鼠成骨细胞

小鼠成骨细胞分离自颅骨组织。成骨细胞起源于间质细胞或骨髓基质细胞，与成纤维细胞、软骨细胞同源，分化过程中“成骨细胞”通常指一个细胞谱系，包括成骨细胞前体细胞、活性成骨细胞、骨衬细胞以及最终阶段的骨细胞。成骨细胞前体细胞(osteoblastprecursorcells)呈梭状，可表达Ⅰ型胶原蛋白，而碱性磷酸酶及骨桥蛋白表达水平较低；活性成骨细胞呈矮柱状，直径约20μn，为单核细胞，通常沿骨表面呈簇状排列，电镜下可见大量的粗面内质网和发达的高尔基复合体，提示其代谢极为活跃，能合成及分泌大量的骨基质蛋白及碱性磷酸酶；骨衬细胞(bone-liningcell)呈扁平状，贴附于骨组织表面，处于“静止”状态，其功能尚不清楚，可能对调节破骨细胞的分化有重要的影响；活性成骨细胞不断地产生骨基质，将自己包埋于其中，并最终分化为骨细胞(osteocyte)，调节骨矿物质的流出与流入。有实验探讨饥饿条件下自噬与凋亡在小鼠成骨细胞中的发生情况与相互关系。培养初代MC3T3-E1小鼠成骨细胞系，将其分为饥饿诱导组与3-甲基腺素(3-MA)预处理饥饿诱导组。其中，饥饿诱导组采用单纯饥饿诱导法，用厄尔氏平衡盐溶液(earle’sbalancedsaltsolution，EBSS)培养1h、2h、3h、4h、5h、6h。3-MA是一种特异性自噬抑制剂，在3-MA预处理饥饿诱导组中，正常培养的小鼠成骨细胞加入3-MA预处理1h后，再用EBSS平衡盐溶液培养1h、2h、3h、4h、5h、6h。应用透射电子显微镜观察饥饿诱导组小鼠成骨细胞自噬与凋亡的形态学变化，应用Westernblot免疫印迹法和AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术检测小鼠成骨细胞中自噬相关蛋白LC3，凋亡相关蛋白caspase3表达水平的变化。结果：透射电镜结果显示单纯饥饿诱导条件下，细胞在2h前以自噬为主，2h后以凋亡为主，并随着时间的延长，凋亡水平逐渐增高。Westernblot免疫印迹法结果显示与饥饿诱导组相比，3-MA预处理饥饿诱导组的LC3转化水平在1h、2h、3h、4h、5h、6h都出产生了明显的下降趋势(P<0.05)；caspase3蛋白表达水平在1h、2h、3h和4h增高(P<0.05)，但0h、5h和6h无差异(P>0.05)。AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术检测结果和单纯饥饿诱导组相比，3-MA预处理组仅在1h、2h、3h和4h促进了细胞凋亡(P<0.05)，而并未影响到0h、5h和6h的细胞凋亡(P>0.05)。结论：饥饿发生后，小鼠成骨细胞的自噬作用通过降低caspase3的活化水平，在细胞饥饿2h前拮抗凋亡作用，随着饥饿时间的不断延长，细胞自噬的表达水平在3h和4h时不断下降，自噬对细胞的保护不断降低，最终走向凋亡，此时自噬对凋亡的发生将不再有任何作用。成骨细胞包括小鼠成骨细胞的主要功能是产生骨基质、分泌Ⅰ型胶原和非胶原蛋白、调节骨基质的矿化和破骨细胞的骨吸收作用。成骨细胞负责骨基质的形成，由于骨基质的形成到矿化需要10天左右，从矿化前沿到距成骨细胞表面5～50μm通常为未矿化的骨基质，称为类骨质(osteoid)。一旦成骨细胞到达骨表面，即表现出合成和分泌胶原、非胶原蛋白和调节因子的能力。所合成的蛋白20%为Ⅰ型胶原，同时还分泌骨钙素、骨形态形成蛋白、胰岛素样生长因子、骨连接素及骨桥蛋白等，促进骨的矿化，在骨重建中起重要作用。这些骨基质蛋白以及碱性磷酸酶呈先后顺序表达，成为成骨细胞谱系的分化标记，而碱性磷酸酶则是成骨细胞分化系列中最重要的标记。成骨细胞还可通过分泌细胞因子、生长因子以及膜接触方式调控破骨细胞的分化与成熟破骨细胞的活化，IL-11、IL-6介导下破骨细胞分化因子(OPG)的表达是该调节作用的关键。同时，成骨细胞所产生的胶原酶也可活化破骨细胞，协助破骨细胞的破骨作用。 成骨细胞包括小鼠成骨细胞自身还可合成多种细胞生长因子和白细胞介素，但同时也接受系统或局部细胞因子的调节。调节成骨细胞分化的激素包括维甲酸A、活性维生素D₃、甲状旁腺激素等，局部微环境中各种细胞生长因子和白细胞介素等对其调控作用也非常重要。各种因素致成骨细胞活性下降均可引起骨质减少并最终导致骨质疏松症的发生，增加成骨细胞的活性是预防和治疗代谢性骨病的关键之一。