嘌呤霉素

嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，分子式C22H29O5N。无色晶体，熔点175～177℃，水溶液对石蕊呈碱性。通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，对革兰氏阳性和阴性细胞以及锥虫、阿米巴原虫和肿瘤细胞等都有抑制作用。嘌呤霉素主治阿米巴感染，也可治疗某些肿瘤病。嘌呤霉素（Puromycin）常用于筛选能够表达pac基因的细胞。pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase)，如果表达该基因，就会对嘌呤霉素产生抗性。这一特性目前普遍应用于筛选表达pac基因的哺乳动物稳定细胞株。目前，很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为 puror)，可以利用嘌呤霉素的筛选，得到特定基因稳定表达的细胞株。Puromycin不仅能用于稳定细胞株的筛选，也用于稳定细胞株的维持。Puromycin的作用特点是快速作用于细胞，一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。作用原理是因其具有与tRNA分子中腺苷相连结的氨基酸末端类似的结构, 能够同氨基酸结合，代替氨酰化的tRNA同核糖体的A位点结合，并掺入到延伸的肽链中。虽然嘌呤霉素能够同A位点结合,但是不能参与随后的任何反应, 因而导致蛋白质合成的终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟的多肽。
嘌呤霉素对原核和真核生物的翻译过程均有干扰作用。嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为puror)，从而利用嘌呤霉素筛选特定基因的稳定表达细胞株。嘌呤霉素也可以用来筛选表达pac基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。
嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期等均有关。为了筛选到稳定表达的细胞株，确定杀死未转染细胞的最低嘌呤霉素浓度至关重要。初次做实验一定要建立适合自身实验体系的杀灭曲线。若细胞对嘌呤霉素耐受性较高，则可能需要大于常规浓度。
嘌呤霉素可引起足细胞损伤，机制还不是非常清楚，有研究认为嘌呤霉素可能是通过引起足细胞氧化应激损伤，导致足细胞内氧化还原系统紊乱，超氧化物增加。不过嘌呤霉素仍常常被用来构建肾病大鼠模型，该模型是研究微小病变型肾病(MCNS)和局灶节段性肾小球硬化的理想动物模型l。但是目前尚未见到利用嘌呤霉素体外构建足细胞损伤的模型，特别是利用该模型研究足细胞相关蛋白尿发生的分子机制的报道，而且由于研究目的不同，所用嘌呤霉素的剂量和处理时间也不尽相同。有研究发现45mg/L嘌呤霉素处理48h后，足细胞发生了明显凋亡，而与75mg/L嘌呤霉素相比，尽管处理时间延长了，但是嘌呤霉素的使用剂量减少了近一半，比较经济；同时利用MTT实验检测了45mg/L嘌呤霉素处理48h后足细胞的活力情况，发现足细胞的活力也明显减弱，裂孔隔膜关键分子Nephrin和Podocin的表达发生明显改变，细胞骨架分布紊乱、解聚，因而体外建立嘌呤霉素致足细胞损伤的细胞模型时，使用45mg/L的嘌呤霉素处理小鼠足细胞48h是比较合适的选择。1. 建议使用浓度
哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定;
大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。
2.溶解方法
用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存;也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。
3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定(以shRNA转染或者慢病毒转导为例)
嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线(kill curve)。
1)Day 1：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜;
2)Day 2：
a)准备筛选培养基：含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0-15μg/mL，至少5个梯度);
b)往孵育过夜后的细胞内更换新鲜配制的筛选培养基;之后37℃孵育细胞;
3)Day 4：更换新鲜的筛选培养基，并观察细胞存活率。
4)根据细胞的生长状态，约2-3天更换新鲜的筛选培养基;
5)每日监测细胞，观察存活细胞率，从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非转导细胞的药物最低浓度。
4. 哺乳动物稳定转染细胞株的筛选
等转染含有pac基因的质粒后，细胞在含有嘌呤霉素的培养基中增殖，以筛选出稳定转染子。
1)细胞转染48h后，将细胞(原样或稀释)置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养。
注意：当细胞处于分裂活跃期时，抗生素作用最明显。细胞过于密集，抗生素产生的效力会明显下降。最好进行细胞分盘使其密度不超过25%。
2)每隔2-3天，移除和更换含有嘌呤霉素的培养基。
3)筛选7天后评估细胞形成的病灶。病灶可能需要额外的一周或者更多时间，这依赖于宿主细胞系和转染筛选效率。注意：每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要48h，有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。
4)转移和放置5-10个抗性克隆到一个35mm的培养皿中，用选择培养基继续培养7天。此次富集培养是为日后的细胞毒性实验做准备。有毒物品剧毒口服-小鼠 LD50: 20 毫克/公斤; 腹腔-小鼠 LD50: 25 毫克/公斤明火可燃; 燃烧释放有毒氮氧化物烟雾库房通风低温干燥; 与氧化剂、食品添加剂分开存放二氧化碳、泡沫、干粉、砂土、雾状水。