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小分子药物因为其可口服的高便利性，易吸收、易穿透细胞膜的高可成药性，成为现代药物开发的基石。但传统的小分子药物采用的是“占位驱动”模式来抑制蛋白功能，导致包括受体、激酶及通道类型等靶点在内的基因仅有约400种可作目标药物，而已知的可成药的基因约3000种。因此，“事件驱动”模式蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimera, PROTAC）技术为新药研发提供了新思路，并成为新药研发的一大利器。

一、蛋白降解靶向嵌合体简介

PROTAC是一种异双功能分子，结构由两个配体通过Linker连接而成，其中一个配体可结合目标蛋白（Protein of interest, POI），另一个配体可以靶向E3连接酶。其本质是存在于所有真核生物中的天然蛋白降解机制——泛素-蛋白酶体途径（Ubiquitin-Proteasome Pathway, UPP）。该途径涉及一个三酶级联反应，即泛素分子在泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）及泛素连接酶（E3）等系列酶作用下，将细胞内蛋白质分类并选中靶蛋白，并对靶蛋白进行特异性修饰，最终形成靶蛋白多聚泛素链并被蛋白酶体识别和降解。其中，E1激活酶和E2结合酶参与的过程称为泛素的激活，单独的泛素本身并没有任何生物功能，只是一种分子标记蛋白，发挥作用的前提是必须有ATP来提供能量。

图片来源：Autophagy and the ubiquitin-proteasome system: collaborators in neuroprotection.

因此，PROTAC是一种“事件驱动”的模式，即它可以和靶蛋白任何位置结合，且不需要高亲和力，就可以诱导靶蛋白降解。PROTACA分子在进入细胞后，其目标蛋白配体可特异性结合靶蛋白，另一端可募集E3连接酶，最终形成POI-Linker-E3 Ligase三元复合物，拉近E3连接酶和靶蛋白的距离，从而诱导E3连接酶为靶蛋白贴上泛素标签，继而促进靶蛋白的降解。随着靶蛋白降解而掉落下来的PROTAC分子可继续被循环利用。

图片来源：Discovery of a first-in-class CDK2 selective degrader for AML differentiation therapy

二、蛋白降解靶向嵌合体体外研究难点

尽管PROTAC因其独特作用机制具有突破性的优势，但PROTAC分子的开发仍面临大量挑战。

口服给药是大多数疾病治疗的理想给药方式，但PROTAC由于其独特的分子结构并不满足“分子量小于500；氢键供体数目小于5；氢键受体数目小于10；脂水分配系数小于5和可旋转键的数量不超过10个”的经典小分子药物类药五原则。PROTAC分子量通常在600~1200 Da之间，一般可达到700 Da以上，且一般伴有溶解性较差、体内外渗透性表现不佳，口服生物利用度通常偏低及吸收较差等情况。

此外，相较于暴露量越多越好的传统小分子药物来说，PROTAC由于结构的复杂性，具有新的挑战。通常，在合适的或相对较低的浓度下，PROTAC可诱导靶蛋白和E3连接酶形成“靶蛋白PROTAC-E3连接酶”三元复合物；然而，当浓度过高时，就易竞争性地出现“靶蛋白-PROTAC”或“E3连接酶-PROTAC”等二元复合物，即“钩子效应”，导致药效降低甚至出现毒性积累。因此，适时地调整PROTAC剂量对于靶向治疗至关重要。

目前现有研究表明PROTAC分子在各种属中均呈现较高的血浆蛋白结合状态，常规的血浆蛋白结合试验可能无法准确的体现其血浆蛋白结合率，而血浆蛋白结合率的测定是必须的。血浆蛋白结合试验可测定化合物在血浆中的稳定性，以防止化合物在高血浆蛋白结合率的情况下出现药物代谢过缓并导致化合物不被清除的现象。同时，PROTAC分子本身结构特殊，分子量大，为提高其渗透性与溶解度，在药物设计时往往需要引入杂原子，且Linker部分在代谢层面其代谢产物的产生可能发生药物毒性作用或药效不足的现象，因此，对PROTAC分子代谢产物的鉴定至关重要。

而根据《药物相互作用研究技术指导原则》，了解转运体介导的药物相互作用也是评价体外药代动力学的重要内容之一。早期常采用Caco2细胞、高表达BCRP细胞或高表达BCRP膜囊泡进行体外评估，然而由于PROTAC分子结构的特殊性，其渗透性一般较差，采用完整的细胞结构可能低估PROTAC分子对外排转运体的抑制作用。

综上所述，对PROTAC分子进行体外DMPK研究至关重要，然而，目前尚无定项针对PROTAC药物研究的指导原则，因此，在实际研究中，研究者往往会参照小分子药物研究的指导原则。

三、PROTAC体外研究策略

尽管PROTAC是一种暂无指导原则的新兴小分子药物，但它“事件驱动模式”的功效性促使药物研发领头军们对其展开了孜孜不倦的研究。目前国内部分药企对PROTAC分子药物的开发已接近国际水平并达到了临床阶段。

图片来源：clinicaltrials, chinadrugtrials,太平洋证券整理

目前常规检测化合物的溶解度通常是利用PH 7.4的磷酸缓冲液，但已有研究报道PROTAC分子在不同状态下（禁食/非禁食）的肠液中其溶解度显著不同，即在肠液中PROTAC分子溶解度相对更高，且非禁食状态下的溶解度效果优于禁食状态的肠液。针对渗透性研究，PROTAC分子的研究遵循了常见的体外模型结构，即可利用Caco2、MDCK和LLC-PK1等模型。

而为防止“钩子效应”、确定血浆蛋白结合率和代谢产物等情况，对PROTAC分子进行体外代谢研究是至关重要的！PROTAC分子体外DMPK研究一般也遵循小分子药物的研究方式，即了解PROTAC药物的代谢关键酶、选择合适的体外模型及测定其血浆稳定性等。

确定代谢关键酶

对PROTAC进行体外药代动力学研究，除了基本的I相（CYP酶）代谢和II相（UGT酶）代谢，已有报道发现醛氧化酶（Aldehyde oxidase, AOX）可参与PROTAC分子的代谢，但存在明显的种属差异，需要多种属验证确保数据真实性。

全血/血浆稳定性试验

作为体外药代动力学早期研究的试验之一，全血中含有丰富的水解酶类，可催化药物的水解代谢，且根据经验发现，全血中不稳定的化合物一般含有酰胺键、磺酰胺键、肽键及酯键等官能团，由此可进一步推断导致PROTAC在全血中不稳定性的位置的可能性。

血浆蛋白结合率测定

已知PROTAC分子在各种属中均呈现较高的血浆蛋白结合状态，所以对其进行种属间比较或体外-体内外推（in vitro-in vivo extrapolation, IVIVE）时需充分考虑化合物在孵育体系中的游离率和全血中游离率数据。

常见的体外代谢研究模型如下：

鉴于PROTAC分子溶解性对外排转运体研究的影响性，采用高表达BCRP膜囊泡模型更具说服力，即膜囊泡可使ABC转运体的底物结合位点暴露于细胞外缓冲液中，更适用于研究候选药物作为底物和抑制剂与ABC转运体的相互作用。

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参考文献:

[1] 药明康德，《药物代谢与动力学：前沿、策略与应用实例》。

[2] Churcher, I., 2018. Protac-Induced Protein Degradation in Drug Discovery: Breaking the Rules or Just Making New Ones? Journal of Medicinal Chemistry 61, 444–452.

[3] Békés M, Langley DR, Crews CM. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue[J]. Nat Rev Drug Discov. 2022 Mar;21(3):181-200.

[4] Goracci L , Desantis J , Valeri A , et al. Understanding the Metabolism of Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs): The Next Step toward Pharmaceutical Applications[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2020, 63(20):11615–11638.

[5] 《药物相互作用研究技术指导原则》。

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