G蛋白偶联受体GPR132，也称为G2A。1998年，Ludwig等人于2003年提出了质子敏感GPCR的概念，并将AGPCR类的四种孤儿受体：GPR4、TDAG8（GPR65）、OGR1（GPR68）和G2A归入该家族。质子感应GPCR的作用最初认为是感应局部pH值降低的组织损伤、炎症或肿瘤生长。然而，G2A的质子敏感性在文献中存在争议。在生理条件下，GPR4、OGR1和G2A普遍表达，其中 G2A在白细胞、中性粒细胞和巨噬细胞中表达最强。G2A在共表达瞬时受体电位香草酸1通道（TRPV1）的外周感觉神经元中表达。在这种环境中，G2A与发育密切相关通过蛋白激酶C（PKC）激活和随后的TRPV1致敏，奥沙利铂诱导的神经性疼痛（OINP）持续存在。因此，抑制G2A是减弱OINP的新方法。G2A也是促进乳腺癌转移的因素。由于G2A在过氧化物酶体增殖物激活受体γ激活时受到转录抑制，因此其抑制可能有助于罗格列酮的抗肿瘤作用，并表明抑制G2A可作为治疗乳腺癌的新策略。
G2A也被认为是脂质受体，溶血磷脂酰胆碱（LPC）是第一个激活剂。然而，LPC 作为G2A激动剂尚不明确。一项关于LPC激活G2A的研究被撤回，其他几项研究证实LPC缺乏G2A激动作用，一项研究甚至得出结论，LPC实际上是G2A 的弱拮抗剂（IC50>10μM）。源自亚油酸（羟基十八碳二烯酸）的氧化脂质，HODEs）或来自花生四烯酸（羟基-叶二十碳三烯酸，HETE）表现出弱至中度G2A激动作用的G2A配体，其中亚油酸代谢物9-HODE认为是最有效的内源性G2A激动剂（图1A）。值得注意的是，G2A的结构与其内源性激动剂形成复合物9-HODE最近用冷冻电子显微镜得到解析。天然细菌产物Commendamide以及N-棕榈酰甘氨酸和N-亚油酰甘氨酸也被发现可作为G2A激活剂，强化了G2A是信号脂质受体而不是质子传感器的概念。化合物SB583831（图1B）和SKF-95667（图1C）是有效的合成激动剂，SB-583831的EC50值在纳摩尔范围内。另一方面，化合物SB-583355（图1D）和替米沙坦类似物GSK1820795A（图1E）为有效的G2A拮抗剂。
G2A激活在造血、脓毒症和急性髓性白血病（AML）中具有潜力。抗癌药物ONC201和ONC212（图1F、G）在β-抑制蛋白募集过程中激活G2A的观察结果的支持其具有抗AML活性。ONC212还在AML中发挥显著的促凋亡作用，但在健康骨髓细胞中没有，并且减少了AML体内的生长，表明G2A激活可能是治疗AML的潜在治疗方法。
总而言之，目前的证据表明G2A激活和抑制对于开发新疗法的潜力。本文介绍了新型有效且选择性G2A激动剂骨架的发现和SAR研究。优化后的类似物在G2A激活功效上超过了内源性激动剂9-HODE，并且具有优异的溶解度和代谢稳定性，从而成为研究G2A的化合物工具。
1、G2A激动剂高通量筛选
为了发现新型G2A激动剂，在无偏高通量筛选（HTS）设置中筛选了Enamine库中的25,000种化合物。化合物均匀地来自文库的所有子集，并且优先考虑含有较多数量的含有羧酸的化合物的文库板，从而在筛选组中产生大约3,000种羧酸。这些化合物在基于功能细胞的测定中以50μM进行测试，检测肌醇单磷酸（IP-1）的积累作为人G2A激活的检测指标。与内源性激动剂9-HODE（EC50=7.5μM）比较效力。选择效力（EC50=1.74μM）和合成可及性方面最有希望的Hit（1，图2）进行进一步优化。
2、小鼠初级感觉神经元的Hit验证
为了验证效果，测试化合物1基于钙成像的TRPV1敏化实验。如前所述，G2A感觉神经元的激活以Gq-PKC依赖性方式导致TRPV1活性增强；因此，作者用两次相同的辣椒素刺激物（100nM，30s）和在第二次辣椒素刺激物之前预孵育的化合物1刺激小鼠初级感觉神经元两次。对钙反应幅度的分析[Δratio（F340/F380）] 表明，化合物1可以有效地对辣椒素诱导的TRPV1反应敏感，且与参考G2A激动剂9-HODE相当（图3A、B）。
首先，合成了来自HTS的原始外消旋产物（1）的两个对映体，从而发现(R)异构体（3命名为T-10418，EC50=0.82μM），其活性比(S)二异构体（2，EC50=31.1μM）强30倍以上。研究了具有高苄基和苯基残基的化合物（4-7），它们的活性明显低于具有苄基残基的Hit化合物，但在立体化学方面表现出相同的趋势。在化合物8-11中测试了一小部分芳香族取代基。结果表明，对位取代（8，EC50=1.96μM；9，EC50=3.34μM）似乎比间位（10，无活性）邻位取代（11，EC50=13.5μM）具有更好的耐受性。带有吡啶环的化合物（13和14）也仅显示出较弱的效力。苄基位置或羧基α位置的甲基取代基是可以耐受的（12和15），但不会提高活性。
接下来，分析了一系列具有或不具有杂原子的脂肪族取代基（16-32）。一般来说，除了化合物19（EC50=7.33μM）和22（EC50=6.87μM）外，该系列的化合物活性较弱（EC50>10μM）或无活性。如果化合物19为(S)-构型，则相应的对映体(R)的活性较低（20，EC50=64.8μM）。然而，化合物19在>20μM时仅表现出非常有限的效力，在这方面明显劣于对映体(R)，这与此前(R)-构型的观察结果一致。最后，带有二氢化茚取代的化合物33仅具有轻微活性。
考虑到第一批化合物（2-33）SAR结果，设计并合成了第二批化合物。第二批化合物的G2A活性如表2所示。
从之前的系列来看，外消旋化合物22是脂肪族取代苯环衍生物中最有前途的衍生物。此后，还合成并测试了其对映体。在这种情况下，与化合物19和20对一样，EC50=2.92μM的(S)-对映体（41）显示出比其(R)-对映体（40，EC50=40.6μM）更高的效力。化合物42和43均为R构型，并且在分子右侧的苯环上具有对位取代基。正如前一组化合物中所显示的那样，这些对位取代基是可以耐受的，但这些取代基并未带来 EC50改进，尽管43表现出最大活化作用。接下来，研究了吡啶环上氮原子位置不同的外消旋化合物。具有邻位氮的化合物48是有效的，显示EC50=2.87μM，而具有邻位氮的化合物49和具有苯环的50仅具有弱活性。最后，中心环中取代基的对位配置的化合物54导致效力丧失。SAR结果如图4所示。
为了将其用作参考工具化合物，还制备了所述拮抗剂SB-583355（56）。在 IP-One 测定中，随后研究了所描述的G2A拮抗剂56（SB-583355） 是否可以抵消化合物T-10418对G2A的激活（图5A）。化合物56以与参考激动剂9-HODE相比相同的剂量反应依赖性方式完全抑制了T-10418的激活。
3.直接结合G2A和β-Arrestin-2招募
通过LC-MS分析从稳定表达人G2A的CHO-K1细胞获得的膜蛋白中T-10418与G2A的直接结合。来自野生型CHO-K1的膜蛋白作为对照。尽管T-10418的亲和力可能在nM范围内，但在较高浓度的T-10418（支持信息图S3中显示的600nM）下，转染细胞与未转染细胞的膜蛋白之间存在微小但具有统计学意义的差异与G2A直接作用。为了进一步表征T-10418作为G2A配体，作者利用分裂荧光素酶互补测定报告β-arrestin2[βarr2；uniport ID P32121]在受体激活后募集至G2A，证实化合物在细胞中的直接与靶标作用（图5B）。
4.直接结合G2A和β-Arrestin-2招募
通过LC-MS分析从稳定表达人G2A的CHO-K1细胞获得的膜蛋白中T-10418与G2A的直接结合。来自野生型CHO-K1的膜蛋白作为对照。尽管T-10418的亲和力可能在nM范围内，但在较高浓度的T-10418（支持信息图S3中显示的600nM）下，转染细胞与未转染细胞的膜蛋白之间存在微小但具有统计学意义的差异与G2A直接作用。为了进一步表征T-10418作为G2A配体，作者利用分裂荧光素酶互补测定报告β-arrestin2[βarr2；uniport ID P32121]在受体激活后募集至G2A，证实化合物在细胞中的直接与靶标作用（图5B）。
5.小鼠感觉神经元的靶标作用
T-10418在小鼠感觉神经元的TRPV1致敏试验中进行了测试；图6为100nM T-10418平均导致244% TRPV1致敏，相当于或超过用400nM 9-HODE处理后观察到的致敏。因此，T-10418比外消旋化合物1更具活性，其中1μM导致的TRPV1致敏作用与使用200nM(±)9-HODE观察到的结果相当（图3）。此外，两种激动剂T-10418和9-HODE的TRPV1敏化作用在与G2A拮抗剂56共同治疗后被完全消除，这为T-10418与靶标作用提供了额外的证据。
6.GPCR选择性
为了评估其作为化学工具的潜力，在测量受体与β-抑制蛋白的关联的PRESTO-Tango测定中测试了T-10418的GPCR选择性。该检测覆盖了300多个非嗅觉 GPCR。除了预期的G2A激活之外，T-10418仅对另一种受体GPR1（人类蛋白质序列）有活性，这表明GPCR具有出色的选择性（图7）。然而，应该指出的是，这种GPCR筛选有其局限性。PRESTO-Tango panel中的300多个GPCR包括大量孤儿受体，对于一些已经表征的受体，在该特定测定中尚未证明参考激动剂的激活作用。此外，不会观察到拮抗剂活性，因为通常只有当测试的化合物充当受体的激动剂时才会预期β-抑制蛋白的募集。此后，化合物T-10418也在Eurofins的SafetyScreen中进行了分析，显示整个组中的特异性结合抑制<25%（支持信息，图S4）。
GPCR1（GPR1；uniprot P46091）由凯莫瑞（一种136个氨基酸蛋白，也称为凯莫瑞-S157）以及凯莫瑞受体家族的其他两个GPCR激活：趋化因子样受体1（CMKLR1）和CC-基序趋化因子受体样2（CCRL2）。Chemerin-S157的C端九肽，称为Chemerin-9（C9），经鉴定能够激活CMKLR126以及GPR1。对于GPR1，仅可检测到抑制蛋白募集，而对于CMKLR1，在配体刺激后也可检测到G蛋白信号转导。因此，确定了T-10418对GPR1和CMKLR1处的内化和βarr2募集的影响。
C9与荧光染料TAMRA（四甲基罗丹明）的结合可以使其定位和细胞摄取可视化。用TAMRA-(EG)4-C9系列稀释液处理表达CMKLR1-eYFP或GPR1-eYFP的细胞，由于配体的结合和细胞摄取，导致TAMRA特异性红色荧光增加。然后通过30μM T-10418共处理来。尽管CMKLR1不受T-10418的影响（图8A），但与不含化合物的对照相比，稳定转染GPR1-eYFP的HEK293细胞的EC50发生了2倍的变化，表明T-10418对GPR1内化的影响较小（图8A、8B、C）。图8D显示了与用作阴性对照肽的TAMRA-(EG)4-scr2C9（乱序C9序列）相比，TAMRA-(EG)4-C9刺激的GPR1内化。
T-10418的调节在βarr2募集生物发光共振能量转移（BRET）测定中更强，该测定测量与βarr2的关联，作为受体配体依赖性激活的读数（图9）。T-10418仅表现出对GPR1的部分激动作用（图9E），这种对βarr2募集的有限刺激导致再次间接测试其效果。与CMKLR1相比，T-10418导致C9诱导的GPR1激活发生显著变化（图9A、B）。与不含化合物的对照相比，60μM浓度的T-10418减弱了 C9刺激的βarr2募集，C9的EC50变化了232倍。当没有内源配体应用于GPR1时，60μM T-10418的部分激动作用达到C9完全激活时观察到的最大βarr2募集的大约50%（图9B，w/o）。在对照组中，抑制蛋白3半最大招募需4nM C9。
最后，按照最近开发的方法进行置换结合测定28（图10）。证明T-10418无法置换Nluc-GPR1构建体上结合的TAMRA标记的C9，而C9显示完全置换，Ki为35.4nM。因此，T-10418根本不干扰C9与GPR1的结合，或者该化合物在正位C9位点处是低亲和力结合（激动剂），其亲和力太低而无法在该实验设置和浓度范围内显示效果。尽管在βarr2 NanoBRET测定中观察到对β-arr2招募的大量刺激（图9B、C），但T-10418介导的C9诱导的GPR1内化抑制（图8B）是有限的，这与GPR1的鉴定一致。PRESTO-Tango选择性（图7）。然而，在NanoBRETβ-arr2招募测定中，T-10418抵消了C9的影响[>EC50（C9）；9C]，因此，T-10418 vs C9对β-arr2招募具有调节作用。当使用T-10418作为药理学工具时，预计GPR1的显著调节仅在≥10μM时发生。对T-10418和GPR1相关化合物的进一步研究将有助于进一步表征其作用模式。
受这些观察结果的鼓舞，继续测试了T-10418与原型咪咪酮ONC201一起对AML细胞的影响。将AML细胞系Molm-13和ML-2与ONC201或T-10418单独孵育或与Bcl2抑制剂ABT-199（称为Venetoclax）联合孵育。ONC201和ABT-199之间的协同效应。72小时后，观察/检测到在ONC201存在的情况下，不存活的Molm-13和ML-2细胞明显减少，而T-10418不影响细胞扩增或活力，如图11所示。
此外，作者证实ONC201和ABT199联合治疗对细胞活力有更强的影响。细胞凋亡的诱导可以通过使用流式细胞术的AnnexinV/7-AAD测量实验验证。AML细胞对ONC201和T-10418敏感性的差异以及对T-10418对G2A选择性的研究结果表明，这些细胞系可能对G2A激活没有反应，并且ONC201诱导了独立于G2A的强抗白血病作用。
因此，作者质疑这些化合物是否激活了AML细胞系中的Gq通路，并在IP-One测定中对此进行了测试。为了跟进之前的实验，首先在表达G2A + GNA11的CHO-K1细胞上测试了ONC201和ONC212。与Nii等人的报告一致，ONC201（EC50=38.6μM）表现出有限的活性，并且低于ONC212（EC50=3.92μM）。为了测试不是由受体介导的任何反应，在仅过表达GNA1但不过表达G2A的CHO-K1细胞上进行了对照实验。当浓度≥30μM时，ONC201和ONC212均刺激IP-1显著增加。以前用9-HODE、T-10418或表1和表2中列出的任何衍生物都没有观察到这种情况。这表明ONC201和ONC212解决了CHO-K1细胞中可以激活Gq途径的一些其他靶标。然后继续在IP-One测定中测试Molm-13和ML-2细胞的反应。用9-HODE、T-10418或ONC212（在G2A上更活跃）治疗后，无法检测到Gq通路的任何激活（支持信息图S5）。因此，ONC201在AML细胞中的强烈作用很可能独立于G2A，这可能解释了T-10418无法抑制AML细胞存活。ONC201和ABT199有明显的加和作用，据Nii等人报道。然而，当ABT-199和T-10418联合使用时，没有检测到额外的抑制作用。
7.T-10418细胞毒性、水溶性、代谢稳定性和体内药代动力学研究
使用CellTiter-Glo作为代谢活性和细胞存活的总体测量方法，在肝细胞癌细胞（HepG2；DSMZ #ACC 180）中测试了化合物1（外消旋）和T-10418（对映体 R）的毒理学特征，在用任一化合物以高达100μM处理72小时后结果均不受影响（阈值≥90%）（支持信息图S6）。
为了评估T-10418是否也适合作为体内研究的化学工具，首先研究了其水溶性和代谢稳定性，这是药物良好吸收和低清除率的关键因素。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液中测定溶解度，并使用大鼠肝微粒体研究体外代谢半衰期（表3）。T-10418表现出非常高的代谢稳定性和大于3mM的优异水溶性。
由于T-10418具有高体外效力和优异的理化性质等有吸引力的特性，因此选择T-10418在雄性C57Bl/6N小鼠中进行PK研究。将化合物以1mg/kg静脉内（iv）施用并以10mg/kg皮下（sc）施用在PBS中。iv研究在15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和8小时测量血浆浓度，皮下研究在30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时和12小时测量血浆浓度。所得血浆浓度分布以及计算的PK参数显示在表4中。静脉注射途径在15分钟后产生最大血浆浓度，然后浓度呈指数下降，直到8小时的最后一次测量。另一方面，当应用T-10418时sc，在30分钟时达到峰值血浆浓度，因此，这又是记录的最早时间点。与静脉注射相比，皮下注射时的AUC接近10倍，这完全符合扫描静脉注射剂量之间的比率。总体而言，该化合物呈现出高血浆浓度和良好的PK特性，这使得T-10418成为G2A激动治疗潜力体内研究的合适候选者。
8.结论
孤儿GPCR G2A正在成为各种潜在治疗应用中有吸引力的靶标，但仍处于实验阶段通过药理学G2A激活来验证治疗效果正在进行中。在本文中发现并优化了一种新G2激动剂骨架。T-10418是其中最有效的G2A激活剂，并在GPCR家族中具有高选择性的特点。T-10418未能诱导白血病细胞系凋亡，表明G2A激动作用不会促进亚咪酮的抗白血病作用。此外，T-10418良好的理化性质和 PK 特性说明其适合作为体内化合物工具。因此，T-10418是研究 G2A 生物学和治疗潜力的非常有价值的工具。
文献来源
Development of a Potent and Selective G2A (GPR132) Agonist | Journal of Medicinal Chemistry (acs.org)
优南官网新闻：药渡Cyber解析强效新颖的GPR132（G2A）激动剂的发现和优化_广州优南科技有限公司 (ynsciences.com)