宿主细胞DNA(Host Cell DNA)是指用于生产生物制品(如重组蛋白、疫苗、生物药物等)细胞中的遗传物质。在生物技术和生物制药行业中,这类生物制品通常是通过在特定宿主细胞中表达目标基因来生产的。这些宿主细胞的类型多样,包括细菌(例如大肠杆菌)、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。 然而在实际生产和纯化过程中,宿主细胞DNA往往会不可避免地迁移到最终产品中,由于其可能导致安全性问题(如潜在的基因毒性或免疫反应),因此,监管机构通常会制定严格的宿主细胞DNA残留限制标准,以确保生物制品的安全性和有效性。
宿主DNA残留标准
我国药典及美国FDA均对宿主残留DNA量进行明文规范:例如2020版《中国药典》明确规定用Vero细胞生产人用狂犬病疫苗,Vero细胞DNA残留应不高于3ng/剂;基于Vero细胞的脊髓灰质炎疫苗,DNA残留量不高于50pg/剂;基于CHO细胞的乙肝疫苗,DNA残留量不高于10pg/剂。
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表 宿主细胞残留DNA的限定标准
随着技术的发展,人们认识到,除了要减少残留DNA的量,也应该降低宿主DNA片段的大小至功能基因大小(大约200bp)以下,从而减少致瘤性和感染性风险。 基于此,CDE 2022年5月发布的《体内基因治疗产品药学研究与评价技术 指导原则(试行)》中明确指出,生产若使用了肿瘤细胞系(如Hela细胞)、致瘤细胞系,或携带有致瘤基因、病毒来源序列的细胞(如HEK 293T细胞),在确保无完整活细胞残留的同时,需对DNA的残留量和残留片段大小进行控制,合理拟定标准限度。如有可能,建议尽量将残留DNA控制在10ng/剂以内, DNA残留片段的大小控制在200bp以下。
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表 宿主细胞残留DNA片段风险等级
去除宿主DNA常见方法
宿主DNA的去除可以通过多种方法实现,每种方法都有其特定的优缺点,目前常见的方法主要为层析法、酶法、沉淀法等。传统单一的方法均存在核酸残留去除不净、工作量大、耗时长等缺陷,广谱核酸酶则可完美解决此类难点。
广谱核酸酶,又称为全能核酸酶,一种来源于粘质沙氏菌(Serratia marcescens,又称灵杆菌)的非特异性核酸内切酶,它不含有原核生物表达的细菌内毒素。无论是实验研究还是工业生产,广谱核酸酶都是目前少有能够同时高效降解任何形式DNA和RNA的酶。
广谱核酸酶的使用与优势
广谱核酸酶能够降解所有形式的DNA和RNA,包括单链、双链、线性、超螺旋和环状DNA、RNA及基因组DNA,对核酸序列没有特异性。在纯化工艺中使用广谱核酸酶,可有效降低细胞裂解液粘度,改善蛋白纯化工艺,高效去除重组蛋白制品核酸污染,大幅降低终产品污染风险,满足法规要求,在细胞治疗、病毒载体疫苗等领域应用广泛。
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核酸酶的作用位点
广谱核酸酶在广泛的条件下仍有很强的生物酶活性,跟大多数生物酶一样,核酸酶的活性也会随温度、pH值、Mg2+、缓冲体系和底物浓度等因素的改变而变化。对于广谱核酸酶使用方法,可以点击小编之前发布的文章《干货分享| 广谱核酸酶的使用,你学会了吗?》进行了解。
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