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经药物代谢酶CYP450 IC50抑制体外评估模型解析一文，我们明确了国家药监局药审中心发布的《药物相互作用研究技术指导原则（试行）》[1]及国际人用药品注册技术协调理事会（ICH）发布的《M12：药物相互作用》[2]指导原则对于药物-药物相互作用（DDI）研究的目标和方向，即代谢酶介导的药物相互作用聚焦在底物/酶表型、抑制剂及诱导剂三个方面。经过可逆性IC50抑制作用体外模型评估，本篇文章将从药物体外代谢细胞色素P450（Cytochrome P450, CYP酶）的反应表型研究方面进行阐述。

Keywords: CYP450, Cytochrome P450, Enzyme metabolism phenotype, DDI

一、药物CYP450酶表型代谢研究

药物代谢鉴定研究，通常被称为反应表型研究，用于确定有助于药物主要消除途径的代谢酶的类型、数量和相对贡献率。根据指导原则可知位于肝脏细胞滑面内质网的细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP）酶系催化的药物代谢是人体内主要的药物代谢方式之一，因此，在首次人体试验前开展合理的体外代谢试验评估CYP450酶与在研药物之间的关系极为重要！

如果药物主要通过单一的代谢途径对药物进行清除，可能会存在很大的用药风险；反之，如果某一药物的代谢过程涉及的代谢酶越多，则说明其代谢途径也越多，也就难以发生潜在的药物-药物相互作用，使得患者之间的治疗偏差降低。如下图所示：以西尼地平为例，IPHASE采用肝微粒体体外温孵技术，研究西尼地平与几种临床常用药物间的代谢相互作用的实例，结果表明环孢素、红霉素和辛伐他丁在体外表现出对西尼地平代谢的抑制作用，由于三者均是CYP3A的抑制剂或底物，这提示西尼地平与CYP3A的抑制剂或底物合用时可能会出现代谢上的相互作用，使西尼地平的代谢速率降低，西尼地平二氢吡啶环脱氢代谢物生成减少，而原型药物的水平显著提高，这可能会影响临床疗效的正常发挥。

综上所述，如果合用的药物具有潜在的抑制或诱导代谢酶的能力，则前者将受到合用药物的影响，从而使其代谢清除途径发生量化的改变，这种药物相互作用可能会影响治疗效果，增加药物的治疗失败率，甚至诱发不良反应。因此，通过对代谢酶表型的体外研究来判定该化合物的主要代谢酶亚型，已成为药物临床前代谢研究工作中必不可少的一部分。

二、药物CYP450酶表型代谢研究方法

据《药物相互作用研究技术指导原则《（试行）》和《M12：药物相互作用》指出：如果物质平衡研究表明代谢是药物的重要消除机制，基于物质平衡研究估计贡献≥25%药物消除的代谢途径涉及的代谢酶通常应被鉴定。这适用于CYP酶和非CYP酶。于前者而言，最常研究的是CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4这7种酶亚型。

多种源自人体肝脏的体外系统可用于考察药物潜在的药物相互作用。

亚细胞的人肝组织组分，如微粒体系统，肝组织匀浆 9000 g离心后的上清液（S9）和胞浆（必要时加入合适辅因子），建议使用至少有10个供体的混合人肝微粒体（Human Liver Microsomes, HLM）；

源于多种表达系统的重组CYP酶或非CYP酶，可用于考察单一药物代谢产物的产生和特定同工酶的参与；

人肝细胞，包括新鲜制备的肝细胞和冷冻保存（Cryopreserved）的肝细胞，它们可保存细胞及酶结构并包含完整的I相和II相药物代谢酶。

其中进行CYP450的酶表型鉴定主要使用选择性抑制剂、重组人源CYP450 同工酶法及相关性分析法这3种方法。选择性抑制法又分为化学抑制法和抗体抑制法，即在加入和不加入一系类CYP450酶亚型选择性化学抑制剂或抗体的条件下，分别测定人肝微粒体对药物的代谢活性，以考察人肝微粒体中CYP450酶亚型倍选择性抑制后，药物的代谢是否受到影响，从而计算相对抑制百分率，推断CYP450酶代谢表型。其中，化学抑制法由于其操作简单，且价格低廉而得到广泛应用。

三、药物代谢酶CYP450代谢表型数据分析

鉴于此，IPHASE以肝微粒体为孵育体系，辅以NADPH再生系统，采用化学抑制法，分别以终浓度为1 μM α-萘黄酮、100 μM 毛果芸香碱、50 μM 噻氯匹定、10 μM 奎尼丁、100 μM 二乙基二硫代氨基甲酸钠、1 μM 酮康唑及20μM 磺胺苯吡唑作为CYP 1A2、CYP 2A6、CYP 2C19、CYP2D6、CYP 2E1、CYP 3A4及CYP 2C9等7种亚型酶的特异性选择性抑制剂，以不含抑制剂的情况为空白对照，测定某一药物在大鼠、小鼠和人肝微粒体中的主要代谢酶亚型，孵育时长为0min和30min,并采用LC-MS/MS进行原型药物浓度的检测。抑制率%=（1- 加入抑制剂样品代谢速率/空白对照样品代谢速率）×100%。

以下结果为结合真实案例的模拟数据，以便与大家共同学习成长。

图1. 大鼠肝微粒中某药物的代谢抑制率

图2. 犬肝微粒中某药物的代谢抑制率

图3. 人肝微粒中某药物的代谢抑制率

由上图可知，不同种属微粒体中，该候选药物的代谢抑制率存在明显差异，即在大鼠中，是CYP2C19为主要代谢酶亚型，而在人中则是CYP1A2，且大鼠和人微粒体的代谢抑制率都表示出了多种酶亚型对某药物的协同代谢；相比之下，犬微粒体对该种药物的代谢仅有3个酶的共同作用，且代谢整体较前两者而言渐缓。因此，不同种属微粒体中参与药物代谢的酶亚型可能不同，这便于更好理解药物的开发及应用方向。

除化学抑制法外，IPHASE以HEK293为载体，构建人源重组蛋白CYP1A2，以相同药物进行酶代谢表型试验验证。期间，重组CYP1A2终浓度为0.2mg/ml，药物终浓度为1uM，辅以NADPH再生系统，采用底物消除法，验证0min，5min，10min及15min时间下的代谢情况，结果如下图所示。

综上所述，我们可观察到使用IPHASE 重组酶CYP1A2同该药物进行孵育后，该药物具有明显代谢，说明CYP1A2是该种药物的主要代谢酶亚型之一，符合化学抑制法的验证结果。因此，无论是化学抑制法还是重组酶法，都可以确认药物CYP450酶的代谢表型，且两者相辅相成，可互相支撑。

然而，试验总是伴随着不同的结果，不同的试验体系也可能出现不同的结果。因此，IPHASE/汇智和源结合过去的项目经验，整理并总结了常见的问题及分析结果，同大家一同学习成长！

1、化学抑制法和重组酶法结果不一致时该如何解释？

答：这两种代谢系统出现的任何差异都不应该叫不一致，而是代谢系统自身的差异导致的正常现象。肝微粒体是直接提取的肝脏的组分，是一种同源的代谢系统，而重组酶是通过蛋白表达系统表达出来的，是一种非同源的测试系统，所以结论中以化学抑制法的结果为主，重组酶法的结果为辅。

2、是否必须采用化学抑制法和重组酶法两种方法试验？

答：代谢表型研究是定性研究，目前的法规和行业观点都认为单一方法无法得出足够可靠的结论，需两种方法结合起来做结论。但一般也认为，结论中以化学抑制法的结果为主，重组酶法的结果为辅。

3、什么情况下需要考虑进行UGT表型研究？

答：在有证据表明UGT是主要代谢酶的情况下需要考虑进行UGT表型研究；UGT表型研究只采用重组酶法来进行，并无UGT亚型特异性抑制剂可采用，但需要注意的是，CYP和UGT甚至包括其他的代谢酶，都可能同时是主要的代谢途径。

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鉴于此，IPHASE作为体外研究生物试剂引领者，以肝微粒体为孵育体系，辅以NADPH再生系统、0.1M PBS缓冲液及CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2C8、CYP3A4和CYP2C9的特异性抑制剂，开发了化学抑制法CYP450 酶代谢表型研究试剂盒，最后通过底物消除法确认结果。此外，为了方便客户的验证，IPHASE也以HEK293为细胞载体，自研构建多种CYP重组酶，为客户提供多种选择！

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