上海雅吉生物科技有限公司

CAT#:15-42900

低温运输，-20℃保存

牙龈卟啉单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒

Porphyromonas gingivalis Probe qPCR Kit

使用手册V1.0

产品及特点

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）是一种非酵解糖的革兰氏

阴性厌氧球杆菌，是研究广泛且证据充足的重要牙周炎致病菌之一。它不仅可以

引发牙周炎，还能导致现在常见的抗生素抗性。它会把对牙齿有益的细菌挤走，

并取代它们的位置。牙龈卟啉单胞菌一旦失控，它最终会导致牙齿从牙龈上脱落

下来。国外有学者研究发现 37%的 0-18 岁个体中均可检测到牙龈卟啉单胞菌，

是人类健康的重大威胁。因此对牙龈卟啉单胞菌进行快速灵敏的诊断具有重要的

意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测牙龈卟啉

单胞菌的试剂盒，它具有下列特点：

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据牙龈卟啉单胞菌高度保守区设计，不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。
5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6. 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
7. 本产品只能用于科研。

格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。
3. 在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4. 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5. 换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7. 如果有N个样品待提取，最好设置N+2个提取，多出的是PC（样品制备阳性对照）和NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为PC。另外用水作为NC。
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

四、数据处理

12. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品核酸浓度的log值，再推算出其浓度。
13. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于38。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于386则为阳性。如果在38-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

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