活性氧（ROS）是细胞代谢的副产物，包括超氧阴离子自由基、过氧化氢、羟基自由基等。它们在细胞信号传导中起作用，但过量产生会导致细胞损伤，并与多种疾病有关。目前针对ROS的检测方法包括荧光染色法、化学发光法、电子顺磁共振技术（EPR/ESR）、电化学生物传感器、色谱法、分光光度法和基于荧光蛋白的方法（表1）。
表1 常用ROS的检测方法
荧光染色法
使用特定的荧光探针如DCFH-DA，可以检测多种ROS，探针本身无荧光，进入细胞后被酯酶水解生成DCFH，随后被ROS氧化生成具有荧光的DCF
化学发光法
利用某些化学物质与ROS反应产生的发光信号来定量ROS
电子顺磁共振技术(EPR/ESR)
直接检测自由基的方法，适用于检测包括羟基自由基在内的多种ROS
电化学生物传感器
利用电化学方法检测ROS，具有高灵敏度和选择性
色谱法
通过色谱分离技术检测特定的ROS或其代谢产物
分光光度法
使用特定的分光光度计来检测ROS，如通过检测硝基四唑蓝(NBT)的还原来检测超氧阴离子
基于荧光蛋白的方法
利用基因工程技术将荧光蛋白与ROS敏感的肽段融合，通过荧光变化检测ROS
检测ROS水平对于理解细胞生理功能和环境因素导致的细胞损伤至关重要。今天小爱带大家重点了解荧光染色法检测细胞内ROS的原理及具体操作步骤。
活性氧检测攻略
一、选择合适的探针
DCFH-DA：这是一种常用的荧光探针，通过检测其氧化产物DCF的荧光强度来定量细胞内ROS水平。DCFH-DA本身无荧光，可自由穿过细胞膜，在细胞内被酯酶水解生成DCFH，随后被氧化生成DCF，其荧光强度与ROS水平成正比。
图1 DCFH-DA探针在细胞内的作用机制[1]
二、 实验步骤（以abs580232，活性氧ROS检测试剂盒为例）
1、装载ROS探针
（1）原位装载探针（仅适用于贴壁细胞）
① 细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞数量小于5×105/mL。
② 药物诱导：去除细胞培养液，加入无血清培养基稀释的药物处理，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。
③（可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照（abs580232，Rosup, 100 mM）到常用工作浓度100 μM，加入细胞，37℃避光孵育30 min-4 h，以提高活性氧水平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa细胞需孵育30-60 min，MRC5人胚胎成纤维细胞则需孵育90 min。
④ ROS探针准备：探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。
⑤ ROS探针装载：吸除处理药物，加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。加入的体积需充分盖住细胞。例如：6孔板通常不少于1 mL，对于96孔板通常不少于100 μL。37℃细胞培养箱内避光孵育30 min。
⑥ 细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞1-2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
（2）收集细胞后装载探针（适用于贴壁细胞和悬浮细胞）
① 细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。
② 药物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药物特性和细胞类型决定。
③（可选）阳性对照：先用无血清培养基稀释阳性对照（abs580232，Rosup, 100 mM）到常用工作浓度100 μM，加入细胞，37℃避光孵育30 min-4 h以提高活性氧水平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa细胞需孵育30-60 min，MRC5人胚胎成纤维细胞则需孵育90 min。
④ ROS探针准备：探针装载前，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。
⑤ 探针装载：除去细胞内药物，离心收集细胞，加入稀释好的探针，使其细胞密度为1.0×106 - 2.0×107。注意：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法，以及检测总量来进行调整。例如：对于流式分析，单管检测内细胞数目不少于104，也不可多于106。
⑥ 细胞清洗：用无血清细胞培养液洗涤细胞1-2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
2、荧光显微镜检测
1、对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取 25-50 μL 细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。
2、荧光显微镜下，选用 FITC 滤光片观察荧光，去除背景观察荧光的变化。
3、流式细胞仪分析
1、对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用 0.5-1 mL PBS 重悬细胞(0.5-1×105/mL)。
2、选择流式细胞仪 FL1 或BL1 通道，488 nm激发，测定 530 nm 的发射，细胞应可分成两个亚群：ROS阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的绿色荧光。
DCFH-DA在ROS检测中的应用
Gao[2]等采用标准荧光探针 2′,7′-二氯二氢代荧光黄二醋酸(abs42197174，DCFH-DA) 来测定脂质体处理后4T1细胞内的 ROS。具体操作流程如下：
1、将 4T1细胞接种在 35 mm 培养皿中，密度为 8×104 细胞/孔。
2、细胞培养24 小时汇合度达到 70–80%后，将脂质体（1 mL，0.1 mg/mL）加入培养基中。配方处理 6 小时后，用 PBS 洗涤细胞三次。
3、用 DCFH-DA（abs42197174，10 μM）染色，孵育 30 分钟后，用 PBS 洗涤细胞三次，然后使用共聚焦激光扫描显微镜进行 CLSM 成像。
图2 4T1 细胞中的 ROS 成像[2]
无论脂质体类型如何，岩藻糖工程化脂质体在4T1细胞中产生的 ROS 都比非靶向脂质体多（图 2），主要是因为细胞摄取增强。由于 DAPC 过氧化，DAPC-Fuc 在 ROS 生成方面比 DOPC-Fuc 更有效。
参考文献：
[1] Rajneesh, Pathak J, Chatterjee A, et al. Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cyanobacteria Using the Oxidant-sensing Probe 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH-DA)[J]. Bio Protoc. 2017;7(17):e2545.
[2] Gao Z, Zhang J, Hou Y, et al. Boosting the synergism between cancer ferroptosis and immunotherapy via targeted stimuli-responsive liposomes[J]. Biomaterials.2024;305:122442.
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