糖尿病是以慢性高血糖为特征的代谢性疾病,由胰岛素分泌缺陷或者作用缺陷所引起,可以分为I型糖尿病和II型糖尿病。胰岛素给药仍然是糖尿病药物治疗的重要方法。今天我们就通过一篇文献来看一下重组人胰岛素的表达和纯化吧。
人胰岛素是人胰岛的β-细胞产生的激素,主要作用的调节葡萄糖代谢。人胰岛素是一个分子量为5808Da的多肽。胰岛素包含两个肽链,肽链A(21个氨基酸)和肽链B(30个氨基酸),中间由两个二硫键桥连接。另外,肽链A还包含了一个链内二硫键。
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胰岛素结构示意图
胰岛素的纯化过程主要分为:质粒构建,细胞培养,包涵体分离,包涵体溶解,复性,纯化等过程。步骤流程见下图:
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下面小编就带大家来一起看一下文章中的具体步骤吧。
01质粒构建
人胰岛素基因的合成主要遵循以下原则:L-B-X-A。L是指先导肽,B是指人胰岛素链B,X是指连接链B和链A的Lys-Arg短肽,A是指人胰岛素链A。使用的质粒是pIBAINS,总共4354bp。质粒构建如下:
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02细胞培养
质粒构建好之后转染到E.coli 20菌株中,在50ml GMS培养基中30℃培养18h,直到600nm吸光值达到0.5-1.0。然后转到7.5L发酵罐中扩大培养。
03分离包涵体
15000xg,15min,4℃离心收集细胞,细胞用裂解液悬浮(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.043% lysozyme),室温搅拌30min,然后加20ml Triton X-100 搅拌10min。细胞用高压均质器裂解,然后18400xg,4℃离心15min。沉淀用50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl and 1% Triton X-100洗涤,18400xg,4℃再离心15min。然后,沉淀用50 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl buffer洗两次。最后,15,000 x g ,4℃,离心15min得到包涵体。
04包涵体溶解
包含胰岛素的包涵体用12mM NaHCO3和0.2mM EDTA溶解。PH用NaOH调为11.9,搅拌45min。然后用HCl把PH调节为10.8。最后24000xg,4℃,离心15min,去除不溶解的杂质。
05复性
溶解之后,通过18h的搅拌和通风进行复性。复性之后,用HCl把PH调节为9。
06胰岛素纯化
胰岛素前体用柠康酸酐处理,来形成胰岛素并且防止胰岛素降解。然后胰岛素纯化采用了3步纯化法,弱阴离子交换层析——强阴离子交换层析——反相层析。先用DEAE阴离子交换层析柱进行初步纯化,然后用Q阴离子交换层析柱进行中度纯化,再用RP-HPLC反相层析柱进行精细纯化,最后再用sephadex G-25脱盐柱进行缓冲液置换。
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相关文献
【1】Zieliński, Marcin, Romanik-Chruścielewska, Agnieszka, Mikiewicz D, et al. Expression and purification of recombinant human insulin from E. coli 20 strain[J]. Protein Expression and Purification, 2019, 157:63-69.
【2】P. Borowicz, A. Płucienniczak, J. Mikołajczyk, T. Głąbski, D. Kurzynoga, D.Mikiewicz-Syguła, et al. New insulin analogs of prolonged activity. European Patent Application EP 2321344A2, 2009
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