上海优宁维生物科技股份有限公司

1、介绍
外周血或全血携带各种血细胞，即红细胞(red blood cells)、白细胞(white blood cells)和血小板(thrombocytes)，它们悬浮在血浆中。血浆主要由水组成，但也含有蛋白质、葡萄糖、离子、激素和凝血因子。从血浆中去除凝血因子就会产生血清。血液中最丰富的细胞是红细胞，其中包括血红蛋白，一种含铁蛋白质。血红蛋白可逆地结合氧气，从而促进氧气在体内的运输。血小板在伤口修复中起着重要作用，它们通过黏附于损伤处并促进凝血方式达到止血效果。哺乳动物血小板没有细胞核，它们由部分细胞质组成，这些细胞质在进入血液循环之前来自骨髓中的巨核细胞。约25%-40%的血小板储存在脾脏中，并在需要时释放出来，其余的血小板在血液中自由循环，周期约为10天。白细胞的各种亚型在免疫应答中发挥重要作用。血液的所有细胞成分都来自造血干细胞(HSCs)。这些多能干细胞位于骨髓，分裂产生潜能较有限的祖细胞：普通淋巴祖细胞和普通髓系祖细胞。常见的淋巴祖细胞可生成T、B淋巴细胞和自然杀伤细胞(NK)，而常见的骨髓祖细胞可生成单核细胞、树突状细胞和粒细胞(包括中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)。最后，产生红细胞和血小板的巨核细胞产生于它们各自的共同祖细胞。
2、白细胞
鉴于白细胞在免疫反应中的作用，白细胞对于了解健康和疾病的机制特别有意义，因此白细胞通常从血液和血液制品中分离出来。白细胞的分类可根据其来源(髓系或淋巴系)或细胞核的形态(单核或多核)以及胞浆中颗粒的存在或不存在而定，可分为两组:i)外周血单个核细胞(pbmc，也称为无颗粒白细胞)和ii)多形核白细胞(pmn，也称为粒细胞)。
 
2.1、外周血单个核细胞(pbmc)
pbmc包括淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)、单核细胞和树突状细胞。除其他特征外，T淋巴细胞和B淋巴细胞的成熟位置和抗原受体是不同的。T细胞在胸腺中成熟并表达T细胞受体TCR，而B细胞在骨髓中成熟并携带B细胞受体BCR。T细胞表达CD3，并进一步分为表达CD4的辅助性T细胞(TH)和表达CD8的细胞毒性T细胞(TC)，。B细胞以表达CD19为特征，通过产生大量抗原特异性抗体来中和细菌和病毒等外来物，并对其进行标记以使其易于被其他免疫细胞识别，从而对病原体产生应答。NK细胞为CD56+CD3-，与T细胞和B细胞来源于相同的祖细胞，但缺乏抗原受体。最后，单核细胞是的pbmc类型，表达CD14。它们在血液中循环13天，然后通常进入全身组织，并可以分化成巨噬细胞和髓系树突状细胞。

表1  pbmc的亚型

 
2.2、粒细胞
粒细胞的特征是在其细胞质中存在颗粒和一个可变的核形状，因此被称为多形核白细胞(PMNs)。中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞都是粒细胞，它们在激活时释放其主要颗粒的内容物。中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞，是炎症部位的个反应者，并发挥吞噬功能。嗜酸性粒细胞被认为参与攻击多细胞寄生虫，如蠕虫。嗜碱性粒细胞与许多特定的炎症反应有关，特别是那些引起过敏症状的反应。嗜碱性粒细胞含有抗凝肝素和血管舒张剂组胺，前者可防止血液凝结过快，后者可促进血液流向组织。
3、基于血液的白细胞来源
白细胞最常用的来源是外周全血。然而，血液制品，如Buffy coat，LRSC和白细胞分离材料，如Leukopak，越来越多地被用作白细胞来源。对于某些应用，尤其是干细胞研究，脐带血和骨髓更适合作为起始材料。血液和各种血液制品的细胞数量和组成各不相同。由于每个应用或研究问题在细胞数量和组成方面都有特定的要求，因此需要选择白细胞的来源。

表2 各种血液产品中白细胞总数的平均频率

流式细胞术检测细胞频率，使用7-Color Immunophenotyping Kit, human;用Sysmex XP-300测定白细胞和红细胞数量。数字表示百分比标准偏差(n≥10)

3.1 全血
所有的主要免疫细胞都可以在最自然的条件下在新鲜抽取的外周血中找到。然而，一个典型的全血样本很少超过10毫升，而且往往更少，特别是当供者是儿童时。从健康的捐赠者那里可以获得更大的样本量，但通常每次捐赠量不超过500毫升。这极大地限制了能从全血中获得的稀有细胞的数量。全血作为血液来源的优点是样本新鲜，这对研究中性粒细胞等敏感细胞至关重要。抗凝剂通常用于血液样本中，以防止血液凝结。肝素、乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸是最常用的抗凝剂。肝素与酶抑制剂抗凝血酶III (AT)结合，导致AT蛋白内部的构象改变并最终激活。活化的AT使凝血酶、Xa因子和其他参与血液凝固的蛋白酶失活。EDTA能强烈且不可逆地螯合Ca2+等二价阳离子，从而防止血液凝固。柠檬酸也被用来结合Ca2+。
 
3.2 Buffy coat
Buffy coat是血液样本中除去红细胞和血浆后含有白细胞的部分。献血后，将450ml血袋离心，得到3个馏分:i)血浆(上馏分)，ii)Buffy coat(中馏分)，ii)红细胞(下馏分)。一般来说，血库只对血浆和红细胞感兴趣。因此，这些部分是从血袋中提取出来的。剩下的物质(Buffy coat)由浓缩的白细胞组成，红细胞和粒细胞数量减少，体积从30到80毫升不等。Buffy coat是常见的pbmc来源，容易获得且相对便宜。
 
3.3 LRSC（Leukocyte reduction system chamber）
血小板从抽取的血液中分离和收集，以便稍后输血给血小板相关疾病的患者。分离的血小板部分仍然含有白细胞，在输注血小板前必须将白细胞清除，以防止排斥反应。为了达到这个目的，利用LRSC，通过孔径的限制使白细胞滞留在滤器中，从而达到去除成分血中白细胞的目的。因此，LRSC包含高密度的白细胞和低浓度的中性粒细胞。
 
3.4 Leukopak
要获得大量白细胞进行研究，一个很好的来源途径是商业上可获得的Leukopak。这是从外周血中收集到的一种浓缩白细胞分离产品，由多种血细胞组成，包括单核细胞、淋巴细胞和红细胞。白细胞和红细胞之间的比率很低(平均为1:1)，粒细胞的数量也是如此。商业Leukopak有不同标准，从一个完整的Leukopak到1/2、1/4规格不等。虽然每个Leukopak的pbmc数目是可变的，但一般保持在一定的范围内。
在某些情况下，捐献者会被注射粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，以诱导白细胞的产生，并触发干细胞从骨髓向血液的迁移。因此，动员型Leukopak与固定型Leukopak相比有更高数量的白细胞，而且各种PBMC亚型的频率也不同。大多数Leukopak来自健康捐赠者，但也有可能要求Leukopak用于某些疾病状态，如过敏和糖尿病。
 
4、脐带血作为白细胞来源
脐带血在出生后保存在胎盘和脐带中，收集脐带血是为了获得用于治疗造血系统和遗传性疾病的干细胞。脐带血包含全血的所有成分，包括白细胞，也富含CD34+造血干细胞。尽管每个捐赠者的CD34+细胞数量差异很大，但通常每根脐带可以收集到1400万个CD34+细胞。在实验基础上，脐带血被越来越多地用作从骨髓中获得干细胞的替代来源。
5、骨髓作为白细胞来源
骨髓(BM)是一种位于骨松质部分的半固态组织，是造血的主要部位。骨髓除含有骨髓脂肪组织和支持性基质细胞外，还含有间充质(mesenchymal, MSCs)和造血干细胞(HSCs)。造血干细胞产生各种血细胞，包括白细胞。骨髓间充质干细胞分化为骨组织中的细胞，包括软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞。骨髓单核细胞(BM MNCs)包括白细胞、干细胞和祖细胞，通过密度梯度离心法从红细胞和粒细胞中分离出来。
6、血液样本的制备
全血可直接用于靶细胞的分离。然而，在某些情况下，以pbmc为起始材料分离特定类型的细胞可能更有效。pbmc可以通过密度梯度离心法或红细胞裂解法从全血中得到。Buffy coat、LRSCs和Leukopak也是产生pbmc的合适样本。最常见的密度梯度离心方法是使用Ficoll Paque，一种高分子量蔗糖聚合物的溶液。血液样本在装有密度梯度介质的试管中离心，以便根据其密度分离其成分。红细胞的密度比血浆高，因此堆积在管的底部，占总体积的45%(在健康献血者的血液中)。白细胞和血小板在红细胞上方形成一层狭窄的Buffy coat。最后，血浆占总体积的55%以下，是一种淡黄色的液体。Buffy coat包含淋巴细胞、单核细胞和血小板，去除血小板，所得的pbmc可用于细胞亚型的分离或其他实验。

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