凝胶电泳是许多分子生物学实验的重要部分。建立核酸电泳需采取一系列步骤来实现核酸样品的分离和分析。核酸凝胶电泳工作流程中的关键步骤包括:
1.选择和制备凝胶
a.琼脂糖凝胶 b.聚丙烯酰胺凝胶 c.凝胶制备中的缓冲液选择
2.准备标准品和样品
a.核酸梯度选择 b.样品和梯度准备 c.加载染料和缓冲液选择
3.运行电泳
a.电泳缓冲选择 b.电压 c.电泳时间
4.在凝胶中可视化样品
a.荧光染色 b.紫外阴影
5.记录凝胶
a.荧光成像 b.射线自显迹法
图1.核酸凝胶电泳的5大关键步骤。
1.选择和制备凝胶
琼脂糖（9012-36-6）和聚丙烯酰胺（9003-05-8）是核酸分离中最常用的两种凝胶基质。两种材料都是三维基质，孔径大小适合核酸分离，且与样品间无反应。可通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的核酸。
有关琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺之间的选择，主要取决于核酸样品的大小和所希望达到的分辨率，虽然凝胶灌制和样品回收的方法也可考虑（表1）。琼脂糖凝胶的孔径大小非常理想，可分离0.1-25 kb范围内的核酸分子。聚丙烯酰胺形成的孔径较小，可用于分离小于1 kb的核酸分子。某些情况下，可采用聚丙烯酰胺凝胶以获得片段小于100bp的单碱基分辨率[1]。
a.琼脂糖凝胶
关于凝胶制备，琼脂糖凝胶通常以粉末形式提供，近年来也有方便的预称重片可供使用。为简化工作流程、节省时间，可考虑预制琼脂糖凝胶，其在某些 市售系统中作为集成单元来运行、可视化和分析。
制备您自己的琼脂糖凝胶，凝胶比例计算为:
凝胶%(w/v)=(琼脂糖g/缓冲液ml)x 100%
凝胶灌制时，如果使用了荧光核酸染色剂（溴化乙锭1239-45-8），可在凝胶灌制时加入推荐浓度（例如，溴化乙锭0.5 μg/mL）。
表2为不同长度的DNA片段分离提供了推荐的琼脂糖凝胶百分比[2]。一般而言，较高比例的凝胶便于更小片段、更好的分离和分辨（图2）。注意，低比例凝胶十分脆弱且难以操作，而高比例凝胶则较浑浊，且会干扰可视化。
图2.不同百分比的琼脂糖凝胶中DNA片段的流动性。在相同条件下（包括运行时间），在1%、2%和3%琼脂糖凝胶上分离出相同的DNA阶梯。1kb片段用红色星号表示，以供比较。
琼脂糖成分
琼脂糖是一种经过纯化的琼脂，是海洋红藻细胞壁的碳水化合物结构组成部分。 琼脂糖是一种分子量约为12万的无支链（线性）聚合物，含有800-1000个单糖。 琼脂糖链由一种重复的异二糖-即-D-半乳糖和3,6-酐-α-L-半乳糖通过1-4糖苷键结合而成。 双糖单位，也称琼脂二糖，通过a-1、3连接形成了一个链（图3）。
图3.琼脂糖的结构单元。琼脂糖由400-500个琼脂二糖单位组成。
琼脂糖溶液加热并冷却后，就会形成凝胶基质。其孔洞直径从50到200纳米不等，由凝胶浓度控制。温度高于90℃，琼脂糖便会融化，变成无规卷曲。冷却后，两个琼脂糖链形成由氢键连接的螺旋纤维。进一步冷却至胶凝固点以下（通常小于40°C），则会有更多氢键连接形成螺旋束网络，进而形成具有三维网格的凝胶（图4）[3,4]。 由于氢键，琼脂糖形成的凝胶加热可逆。因此，通过溶解含有目的片段的凝胶，可提取电泳分离出的核酸。
图4.通过加热和冷却改变溶液中琼脂糖的结构。
对大于10kbp DNA的提取，低熔点（LMP）的琼脂糖是较合适的选择。LMP琼脂糖在65度左右（1%的凝胶）融化—相对较低的温度，确保可以温和地提取凝胶中完整的核酸大分子。 LMP琼脂糖的低凝胶温度（~25°C）使其成为凝胶内酶反应的理想选择（例如，连接）。酶在半固态的琼脂溶液中处于活跃状态。
b.聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺-丙烯酰胺和交联剂—双丙烯酰胺（简称为“bis”）的组分-可以粉末形式提供，但为了方便通常预先制备成原液。该粉末和液体形式是为大家所知的神经毒素，应使用实验室防护性设施，小心操作。在凝胶中，丙烯酰胺和双丙烯酰胺（以%T表示）的总浓度决定了孔隙大小—通常直径为20-150纳米。百分比越高，孔隙越小，可分辨的分子也更小。表3展示了常用的凝胶比例[2]。
核酸分离，通常采用3–30%（%T）的聚丙烯酰胺凝胶。除%T之外，双丙烯酰胺（交联剂）与总丙烯酰胺（%C）的重量百分比是聚丙烯酰胺凝胶孔隙大小和样品分离的的关键（表4）。
%T和%C可以表示为：
%T(w/v)=[(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g/缓冲液ml]x 100%
%C(w/w)=[双丙烯酰胺g/(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g]x 100%
聚丙烯酰胺的基本原理
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体聚合而成的聚合物，通常与双丙烯酰胺或N,N'-亚甲基双丙烯酰胺结合使用。交联剂双丙烯酰胺含有两个单位通过亚甲基桥连的丙烯酰胺。聚合是被TEMED 催化（N,N,N′,N′-四甲基乙二胺）的自由基反应-通常由过硫酸铵（APS）引发（图 5）。因此，在既定温度下，APS和/或TEMED的浓度决定了聚合速率。
图5.丙烯酰胺形成聚丙烯酰胺，双丙烯酰胺结构展示。双丙烯酰胺含有两个单位通过亚甲基桥连的丙烯酰胺（红色）。
c.凝胶制备中的缓冲液选择
使用具有导电性的离子溶液制备琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶，确保核酸在电泳过程中具有迁移性。电泳过程中，凝胶和电泳缓冲液通常使用相同类型的缓冲液，以保持相同的pH值和离子强度。核酸电泳常用的两种缓冲液为Tris-醋酸盐EDTA （TAE）和Tris-硼酸盐EDTA （TBE），两者都有接近中性的pH值，有利于带负电荷的核酸。
为分析单链DNA或RNA，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶通常在变性条件下制备和运行。变性条件会破坏核酸之间形成的氢键，从而减少像发夹环这样二级结构的形成。因此对RNA分离和分析而言，变性电泳更常用。琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶核酸电泳中常用的变性缓冲液包括:
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琼脂糖：磷酸钠缓冲液中的乙二醛和DMSO、NaOH-EDTA缓冲液、MOPS缓冲液中的甲醛或甲酰胺等
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聚丙烯酰胺: TBE缓冲液中的尿素
2.准备标准品和样品
a.核酸标准品选择
当运行凝胶时，含有已知大小的核酸参照样品通常被称为标准品、标记或 分子量标准，用于目的样品大小的估计。 在为给定样品选择合适的分子量标准时，需考虑如下因素:
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Ladde类型（例如DNA或RNA），片段结构（例如单链或双链），构象（例如超螺旋、开环或线性）以确保对迁移进行适当比较
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片段的数量和适当的分离形式，用于大小的估计
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预期用途，如分子量标准是设计用于定性分析还是精确的定量测定
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不同类型凝胶适用的分子量标准（例如，部分预制凝胶推荐设计 特定分子量标准以获得运行结果）
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上样染料的性质，避免目的条带模糊（图6）
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上样缓冲液与使用凝胶的兼容性（例如，缓冲液的盐浓度会影响样品的迁移）
早期，DNA的大小标准主要来源于病毒基因组片段(（例如,λφX174）和细菌质粒（如pUC19）的限制内切。该标准物在内切、样品纯度和电泳中带型的重现性方面存在问题。而后，从连接反应和/或PCR中获取的含有片段的分子量标准，因具有再现性且可产生预期大小的片段，而备受青睐。如今，因为色谱纯化片段实现了质量、带型、强度和数量等方面的更高控制，被视为分子量标准黄金标准（图6）。
图6.DNA 分子量标准差异。 分子量标准 #2由色谱纯化的DNA片段组成，存在于上佳的上样缓冲液中，可产生相等或预期强度的条带，并且不含有条带污点，无染色阴影。 与此相反，分子量标准 #1采用较老技术制造，并存在于次优组分的缓冲液中。
此外，还设计出室温下稳定、适合运输和储存，以及方便和少环境影响的分子量标准。而预混合，即用型分子量标准也可供选择—添加了浓度、可直接上样到凝胶的上样染料的分子量标准。
注意，由不同制造商生产、描述相同（例如，1kb或100bp）的分子量标准，包含DNA片段的数量、大小和密度可能会有所不同（图7）。使用前，请参考制造商提供的指南和协议，获取分子量标准组成及其使用用途准确而详细的说明。
与DNA分子量标准不同，RNA分子量标准通常与含有变性剂的上样缓冲液一同提供。变性剂可维持RNA的单链形式，确保样品可预测的迁移和分离结果。当运行RNA凝胶电泳时，应避免使用DNA分子量标准，因为双链分离，在变性条件下使用会导致非规则方式分离。
图7.两个不同供应商A和B，提供具有相同描述的DNA分子量标准片段组成差异。
b.样品和标准品准备
须计算上样到凝胶中的DNA量，以确保目的条带良好分离，并用于可视化和检测。虽然用荧光染料足以检测1-100ng/条带的DNA，但最小可检测量取决于所用染料[6]。注意，样品或标准品的超载会造成条带污点并遮盖附近条带，从而导致条带分辨不清，特别是片段大小相似时（图8A）。
图8.次优样品分离。 (A) 负载影响条带分辨率。 (B) 上样量过低会导致条带扭曲。
在上样缓冲液中准备好样品和分子量标准，其最终的体积通常占胶孔体积的30%。 由于孔底分布不均匀（图8B），使用较少的上样体积会导致条带扭曲。对于含有DNA结合蛋白或粘性末端的样品，凝胶上样之前，混合物需加入至含有SDS的上样染料中一同加热，因为蛋白质结合以及DNA片段之间的相互作用会导致分离效果不佳（图10B）。
c .上样染料和缓冲液选择
制备凝胶电泳时，样品中添加了凝胶上样缓冲液 (通常是6X或10X的原液)。 上样缓冲液包括如下组分:
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密度成分，如甘油或蔗糖，增加样品粘度，确保样品沉入孔中。
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盐，如Tris-HCl，为样品创造良好的离子强度和pH值环境。 高盐浓度的上样缓冲液会产生更大片或扭曲的条带以及污点。
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金属螯合剂，如EDTA，可阻止样品中的核酸酶降解核酸。
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染料 为监测样品的上样、电泳进展和pH值变化提供了颜色指示。 部分上样缓冲液可能包含多个染料，以便有效跟踪样品中不同大小分子的迁移。
通常，上样染料都是带负电荷的小分子，因此迁移方向与核酸相同。 其中有的显示pH值颜色，上样和运行时可作为样品的pH指示剂(图9A)。 常用染料包括溴酚蓝、二甲苯青,苯酚红,和橙色G。选择上样缓冲液时,需注意染料的表面迁移(s)(图9B, 表5和6)以避免遮盖目的核酸条带,特别是分子大小接近时(图9C)。 染料遮盖会影响目的条带的分析和量化，导致结果不可靠。
图9.(A)中性pH中染料颜色。(B)在TAE和TBE缓冲液中不同百分比琼脂糖里的染料迁移。(C)在可视化过程中染料阴影遮盖条带。
有时,上样缓冲液包含清洗剂或还原剂，如SDS, 尿素和甲酰胺，以用于变性。此类添加剂可破坏核酸分子内部和分子间的相互作用，促成线性或单链的分子构象。为获得分离结果，应将样品和变性剂加入至上样染料中一同加热（图 10A）。对来源于酶反应的双链DNA电泳，可将SDS添加到上样缓冲液，以破坏蛋白质和核酸之间的相互作用，防止样品迁移性改变（图10B）。
图10,热量、SDS对样品电泳的影响。(A) 在不加热处理的情况下，将含有RNA分子量标准的变性缓冲液加入凝胶中。 (B) 在有或无SDS的上样缓冲液中准备来源于限制性内切和连接反应的DNA样品。 在凝胶上样前，加热SDS中的样品。
3.运行电泳
在凝胶、标准品和样品制备后，进行电泳。拆卸梳子和添加电泳缓冲液前，凝胶须完全凝固。凝胶梳应平稳地向上提起，以免撕裂凝胶、扭曲胶孔。移除梳子和添加缓冲液后，注意清除孔里的气泡。对于聚丙烯酰胺凝胶，应用缓冲液彻底冲洗胶孔，以清除残留未聚合的丙烯酰胺。
水平凝胶应朝向凝胶盒，样品孔位于负极一侧，以便在电泳启动后，将样品移动至正电极侧（图11A）。该方向可记为“跑向红色”，因为正电极通常为红色。 垂直凝胶盒中，胶孔设计在顶部（图11B）。
图11.水平和垂直电泳系统的凝胶装置。 箭头表示电泳中核酸迁移的方向。
a.电泳缓冲液选择
电泳缓冲液为具有缓冲能力的离子溶液，通常在凝胶中使用，以保证电流流动同时防止pH值变化。电泳过程中，由于电子流动，负极逐渐偏向碱性，正极逐渐偏向酸性，从而导致水电解和pH值改变（表6）。氢气和氧气的释放会引起电极起泡，这是凝胶运行的迹象。理想情况下，电泳缓冲液和凝胶制备缓冲液应相同，以确保有效的导电性。
表6.两个电极的化学反应和pH值变化。
电泳缓冲液的选择取决于样品大小、运行时间和后电泳过程，其中Tris-醋酸盐EDTA（TAE）和Tris-硼酸 EDTA（TBE）是最常用的两种缓冲液（表 7）[2,7]。
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因为不容易形成污点，TAE适用于>1500bp的片段。由于缓冲能力较低，TAE更适合短时间的电泳运行(例如<2小时)。TAE缓冲能力较低，长时间运行凝胶会导致过热，样品变性和/或扩散以及凝胶融化（可能）。
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TBE缓冲能力较高，不易导致过热，因此更适合长时间运行。对于较短片段的分离，TBE效果更佳，而在TBE中，dsDNA迁移得更慢。TBE可抑制酶，因此不适合涉及酶学步骤的下游应用，如限制内切、克隆和PCR。
使用离子强度高于1X TAE或0.5-1X TBE缓冲液，可更快地移动样品，但由于高导电性会产生大量的热量，容易导致样品变性和凝胶损伤。
凝胶应完全浸在缓冲液中，以确保离子流动，防止凝胶干（图12A）。然而，当使用水平凝胶时（例如，琼脂糖），凝胶上的缓冲液深度应低于3–5mm。缓冲液过高（>5 mm）会导致核酸迁移性降低，加大条带扭曲和过热。
图12.电泳缓冲液对电泳的影响。(A) 在电泳过程中，凝胶的顶部部分未被浸没。(B) 在低于推荐浓度的盐浓度缓冲液中运行凝胶（与凝胶制备中使用的缓冲液不同）。
注意，变性琼脂糖的电泳缓冲液可能既不是TAE，也不是TBE，因为这些凝胶可能在不同的缓冲液中制备，如磷酸钠和MOPS。选择与所用凝胶兼容的电泳缓冲液非常重要（图12B）。
b.电压
采用恒定电压、电流或功率通过凝胶，施加电势，开始运行凝胶。核酸电泳中常用恒压，一般为5–10 V/cm。
施加的电压(V)=电极间的距离(cm)x建议V/cm
可根据需要分离的DNA片段的大小调整电压，也可以根据所使用的电泳缓冲液的类型进行调整（表 8）。市售核酸分子量标准通常提供建议电压，以便每个产品片段实现分离。注意，电压极低会减缓核酸的迁移，从而导致小分子的扩散和分辨率过低（图13A）。另一方面，电压过高，会导致较差的分离效果和样品污点；有时，还会造成缓冲液过热，“微笑型条带”，甚至是样品变性（图13B）。
图13. 电压对DNA电泳的影响。 (A)低电压导致条带分辨率差和扩散。 (B)高电压导致“微笑型条带”。
某些情况下，可将温度探头连接至凝胶装置，以帮助控制缓冲液的冷却和加热。 电泳运行>2小时，缓冲液的冷却和再循环可改善样品分离。变性凝胶允许缓冲液加热至55°C，从而改善核酸单链形式，提升实验结果。
c.运行时间
凝胶长度、所用电压和样品中的分子大小决定电泳所需的时间。通常，电泳会持续到目的条带迁移至凝胶长度的40-60%。凝胶运行的特定时间，可观察到上样染料的相对位置，直至溴酚蓝染料已迁移约60%的凝胶长度和/或橙G染料已迁移80%的凝胶长度。此外，应监测运行时间，以确保样品或标准品中最小的分子不移出凝胶。注意，运行时间过短则不能完全分辨条带（图14）。含有示踪染料的DNA分子量标准可协助监测凝胶的运行，同时也可确保条带不被染料所遮盖。
图14.运行时间对样品分离的影响。
4.在凝胶中可视化样品
凝胶运行完成后，需对样品进行可视化分析。由于普通照明环境下，核酸不可见，因此需要一种可视化的检测方法。如表9所述，可用方法在样品检测中，提供了不同的灵敏度和增益范围[6]。
a.荧光染色
现有的染色剂中，因荧光染料易于使用，灵敏度高，所以在样品检测中应用最为广泛(图15)。 当用适当波长激发时，染料发出可见光(即，荧光)。荧光强度与其和核酸结合的数量有关—这是检测和定量测定电泳中核酸的基础。
图15.不同类型的核酸结合染料。
溴化乙锭(EtBr) 染色时间短（约30分钟），灵敏度高（可检测到1 ng双链DNA/条带），为核酸电泳中的常用荧光染料。还可考虑另一种染料，原因如下:
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诱变和处置: 溴化乙锭是高度诱变剂，所以荧光染料的 危险性较小，无需特殊处理，在核酸电泳中可提供安全工作流程(图16)。
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灵敏度：灵敏度高于EtBr的荧光染料，适合检测少量样品(图16)。 因为有较少的碱基堆积，单链核酸的可视化通常需要更多样品和/或嵌入染料。 因此， 优先结合单链核酸的染料是RNA电泳样品检测的选择。
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紫外线损害：可用低能量蓝光（而非紫外光）来激发的荧光染料对核酸结构损伤较小，其灵敏度（图17A）不仅相同，甚至更高。 因此，电泳中使用蓝光激发可提高下游的成功应用，如克隆和测序（图17B）。
图16.特性增强的溴化乙锭替代品
图17.(A)常见核酸染色的激发和发射光谱。最有效的波长被称为激发极大值。SYBR安全与SYBR金染料通过蓝光和较低的紫外光可程度激发。(B)用蓝光(针对SYBR安全染料)或紫外光(溴化乙锭)后的克隆效率，用于在电泳过程中显示克隆插入。用x-Gal培养皿上形成的蓝色菌落数量来衡量胶-纯化lacZ片段的克隆效率，其表明已将功能(未突变的)基因插入到载体中。
b.紫外阴影
在染料染色处，可通过称作紫外阴影的方法间接观察核酸，利用核酸[8]来吸收紫外线。该方法通常用于通过电泳分离和纯化寡核苷酸和RNA，这种情况下，简单检测已足够，和/或使用嵌入染料会影响下游的应用。为通过紫外阴影进行检测，需要纳克到微克的样品，并使用薄而透明的凝胶（如聚丙烯酰胺）以确保紫外线的吸收和透射。紫外阴影方法中，电泳后将凝胶从盒中取出（以便程度检测），用透明的塑料薄膜包裹后放置在UV-荧光薄层色谱板上。当凝胶至于紫外线辐射下时，核酸条带的吸收会在TLC板上投射阴影（图18）。将所需大小凝胶的阴影部分剪去，以作进一步处理。
图18.紫外阴影使分离的片段显象。
5.记录凝胶
a.荧光成像技术
可视化后，核酸凝胶通常被存档记录下来，用于记录和分析电泳结果。如果样品被荧光染料染色，需特殊设备以适当的光源激发染料，使其显象并捕捉凝胶图像。激发光源在凝胶上，称为反射照明器（类似于手持式紫外线灯），或在凝胶下，称为透照器 (图19)。由于反射照明器上的光源位置较远，所以样品收到的能量较少。这样可以减少紫外线对核酸的损害，但也会降低凝胶条带的信号。另一方面，透照器可为条带提供更高的信号，但由于辐射接近凝胶，会增加紫外线造成的伤害。
图19.反射照明器和透照器。
b.放射自显影法
在放射性核酸的电泳过程中，凝胶电泳后会暴露在x射线胶片上，这一过程即称为 放射自显影法。条带辐射的强度可用光密度测定来定量。
综上所述，核酸电泳工作流程采用多种步骤和试剂来分离和分析样品。为您的样品选择合适工具，并识别工作流程的优缺点，可显著提高分子生物学应用的电泳结果。
参考文献
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