CNBr活化的琼脂糖在制备和使用定制亲和层析填料方面具有良好的记录。将生物特异性配体与CNBr活化的琼脂糖偶联是一项广泛使用、成功且有据可查的技术。偶联反应是自发的、快速的并且易于进行。不需要有毒化学品或特殊制备。
这种预活化的琼脂糖基质可以很容易地用于制造各种亲和层析填料，适用于小规模和大规模纯化应用。应用领域包括蛋白质、多肽和核酸的固定化。
- 属性
CNBr活化琼脂糖层析填料(CNBr-activated SepFast 4 HF)由高度交联的4%珠状琼脂糖制成。它具有高机械刚度，可在降低背压的情况下实现高流量。
由于琼脂糖具有出色的亲水性和低非特异性结合特性，长期以来一直用于色谱分离。这些颗粒具有开孔结构，对大蛋白质分子具有出色的传质性能。
基础基质与溴化氢（CNBr）反应生成活性基团，这些活性基团与待固定分子中的伯胺基团反应。CNBr活化琼脂糖层析填料(CNBr-activated SepFast)以添加添加剂的冻干粉形式提供。
表1 CNBr活化琼脂糖层析填料(CNBr-activated SepFast 4 HF)的特性
- 配体固定化
以下是配体一般的偶联流程。
2.1 将目标配体溶解在含有0.5 M NaCl的0.1 M NaHCO3，pH 8.3的偶联缓冲液中。对于蛋白质配体，凝胶浓度为5 - 20 mg/ml。对于小配体，制作1 - 10µmol/ml凝胶。偶联缓冲液的体积应与固定凝胶的体积相同。
2.2 称取所需的粉末（1 g干粉提供约9 ‑ 12 ml的沉降填料）并将其悬浮在预冷的 1 mM HCl中（1 g 干粉使用20 ml预冷的1 mM HCl）。让填料在低温下膨胀2 - 3分钟。
2.3 快速去除过滤装置中的液体。
2.4 将洗净吸干的凝胶转移到偶联缓冲液中。
2.5 浆液在4℃下混合过夜或在室温下混合3-4小时。
2.6 用至少5 倍凝胶体积的偶联缓冲液清洗凝胶。
2.7 将凝胶重新悬浮到相同体积的封闭溶液中，0.1 M Tris/HCl，pH 8.0 或1 M 乙醇胺 pH 8.0，持续2 - 3小时。
2.8 用5倍体积的0.1 M 0.1 M Tris/HCl + 1 M NaCl，pH 8.0洗涤凝胶，然后用5倍体积的0.1 M醋酸盐缓冲液 + 1 M NaCl，pH 4.0洗涤凝胶。
2.9 使用前用工作/平衡缓冲液清洗凝胶。
- 固定化效率的一般考虑
3.1 pH
pH 8.3的缓冲液最常用于蛋白质固定。然而偶联pH值可在6-10之间进行优化以获得结果（例如，高偶联产率和高配体活性）。
注意：配体溶解后要调节偶联pH值。
3.2 偶联方案
应避免使用含有氨基的溶液。
可以引入稀释的某些有机溶剂以提高配体的溶解度。应事先测试此类溶剂的适用性。
3.3 盐
偶联缓冲液中盐的存在可以提高固定效率。
3.4 基础基质中的活化基团
对于某些配体或应用，基础基质中的活化水平可能过高，偶联配体的活性可能会降低。
在降低的pH值下偶联可能会减少配体分子的连接点。它可以提高偶联配体的活性。活化基团的受控水解，例如在添加配体前几个小时用偶联缓冲液孵育凝胶，也可以减少过度偶联问题。
3.5 屏蔽剩余的活化配体
未与配体反应的活化基团应通过添加额外的含有pH 8 - 9伯胺的小分子（例如Tris或乙醇胺）来封端。
3.6 最终填料的洗涤
偶联反应后需要将未连接或弱连接的配体完全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗涤方法可以确保有效去除不需要的物质。
- 固定化亲和填料的使用
配体偶联填料可用于使用间歇搅拌罐模式或填充柱模式的纯化。处理这种材料遵循与处理其他基于琼脂糖基质相同的原则。
- 储存
冻干的CNBr活化琼脂糖层析填料(CNBr-activated SepFast 4 HF)应在8℃下储存。偶联的湿填料应在防菌剂（例如20%乙醇）存在的情况下于4-8℃储存。切勿冻存耦合填料。
- 更多信息
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