类器官在药敏药筛这块的活力检测方法采用ATP生物发光技术的方法相对其它方法更简便,更准确。小爱带您了解一下检测方法吧。
1、ATP生物发光技术原理
在类器官细胞培养物中加入相应试剂使类器官裂解,释放ATP,荧光素酶催化底物荧光素的转化,高效利用ATP的能量,发射光子形成光信号。发光强度与ATP在一定范围内成正比,而ATP又与活细胞数目又呈正比,因此可以对类器官活细胞数目进行定量检测。
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2、类器官ATP生物发光方法
(1)类器官的准备
使用适合进行发光检测的 24孔板,每孔接种类器官与基质胶混合物25ul 平铺到孔底部,同时设置不含类器官的基质胶与培养液孔作为阴性对照,按照类器官培养的常规方法培养类器官。如有需要,可加入药物处理类器官。此外,如有必要,也可以设置类器官的浓度梯度,以便后续确定试剂盒的使用效果。
(2)试剂准备
a. 融化:将ATP活性检测试剂盒置于 2 ~ 8℃或室温条件下融化。
b. 使用前轻柔颠倒几次使溶液混合均匀。
(3)检测步骤
a. 于培养箱中取出待测类器官培养板,室温放置 30 min,以使培养板温度平衡至室温。
b. 加入与待测类器官培养物等体积并平衡至室温的缓冲液(abs9730)。例如,使用 24孔培养板时,先去除类器官培养基,用类器官缓冲液置换静置清洗 3 次,然后吸取 25μl 本品加入 25μl 待测类器官培养物中(加入体积与基质胶
团混合物体积一致)。
c. 剧烈振荡 5 min 使类器官充分裂解;室温放置 25 min 以稳定发光信号,即可进行检测。
d. 使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置相应的参数,每个孔的检测时间一般为 0.25-1 s或更长时间,具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。
e. 根据化学发光读数直接计算类器官的相对活力,或根据 ATP 标准曲线计算出 ATP 的量从而计算出类器官细胞的相对活力。类器官在 0-30个类器官/孔的类器官密度范围内有良好的线性关系,ATP 标准品 0-10,000nM 浓度范围有良好的线性关系。
注:检测效果因类器官的种类不同而有所不同,对于一些 ATP 含量特别高的类器官,在类器官数量达到 100 个后可能会不呈现线性相关,但化学发光读数还是会继续升高的。
(4)ATP 标准曲线的设置(选做): 把自备的 ATP 标准溶液用 PBS 或类器官培养液稀释成适当的浓度梯度。初次检测可以设置 0、10、30、100、300、1000、3000、10,000nM 这几个浓度,24 孔板每孔加入 100μl 的标准品。如有必要,在后续的实验中可以根据类器官中的 ATP 含量对标准品的浓度范围进行适当调整。如果用类器官培养液来稀释 ATP 标准品,稀释后需立即进行后续的发光检测,否则培养液中的 ATPase 等可以消耗 ATP 的酶会导致 ATP 含量下降。
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