高纯质粒大提试剂盒
一、产品简介。
本产品是一款从工程菌内大量提取质粒 DNA 的试剂盒，并能够去除蛋白质与 RNA，得到高纯度的质粒 DNA，用于转染和酶切等生物学实验。
二、运输与存储条件。
本试剂盒中的 RNase A 需低温运输，-20 ℃保存，其它组份常温运输与保存，有效期 12 个月。
三、特点与优势。
1. 有效去除蛋白质与 RNA，得到高纯度的质粒 DNA。
2. DNA 纯化柱可结合 5 mg 质粒 DNA。
四、使用说明。
1. 试剂配制：
a) Buffer P1 (重悬液) 配制。将 RNase A 全部加入 Buffer P1 中，混匀，4 ℃保存。
b) Buffer W3（漂洗液）配制。溶液中加入 70 mL 无水乙醇，混匀。
2. 细菌收集。将菌液加入 50 mL 离心管，12,000×g 离心 2 min，弃上清。剩余菌液加入对应的离心管中，再次离心并弃上清，直至所有菌液收集完毕，将离心管倒立在纸巾上，吸尽残余液体。
3. 加入 7.5 mL Buffer P1（确定加入 RNase A），振荡（vortex）至细菌完全重悬。（若细菌沉淀没有完全重悬，会影响裂解效果，降低质粒 DNA 提取量。）
4. 加入 7.5 mL Buffer P2（室温较低时，Buffer P2 易沉淀，请在 37 ℃水浴锅中加热 10 min，待沉淀消失后再使用），轻柔地上下翻转 20 次，液体变透明，保证细菌充分裂解。
（不要剧烈震荡（vortex），以免 DNA 断裂。裂解时间不宜超过 5 min，以免质粒 DNA 受到破坏。细菌充分裂解后液体变得清亮粘稠。如果仍然浑浊，则细菌过量，裂解不彻底，应加大裂解液用量。）
5. 加入 10.5 mL Buffer P3，立即温和地上下翻转 20 次，充分混匀，出现白色絮状沉淀。（混匀要充分，以免出现局部沉淀，影响中和效果。）
6. 12,000×g 离心 10-20 分钟，上清转入新的 50 mL 离心管中。（尽量避免吸取白色沉淀）
7. 上清加入 DNA 纯化柱，12,000×g 离心 1 min，弃滤液。剩余的上清液依次加入相应的 DNA 纯化柱，12,000×g 离心 1 min，弃滤液，完成 DNA 吸附。
8. 加入 5 mL Buffer W1（去蛋白液），12,000×g 离心 2 min，弃滤液。
9. 加入 5 mL Buffer W3（漂洗液），12,000×g 离心 2 min，弃滤液。
10. 空的 DNA 纯化柱，12,000×g 离心 3 min，尽量去除 DNA 纯化柱中残余液体。
11. 将 DNA 纯化柱转移至新的 50 mL 离心管（质量好的离心管，确保不会因为离心过大而破碎，从而导致质粒提取失败），在柱中央滴加 2 mL Elusion Buffer D 或 ddH2O，室温静置 5 min。
12. 12,000×g 离心 2 min，收集质粒 DNA 溶液。
13. 在纯化柱中央再次滴加 2 mL Elusion Buffer D 或 ddH2O，室温静置 5 min， 12,000×g 离心 2 min，收集质粒 DNA 溶液。（本试剂盒中的 DNA 纯化柱为高结合力的核酸纯化柱，需要洗脱两次以上才能将吸附的质粒完全洗脱下来）
14. 测定质粒 DNA 浓度，或置于-20 ℃冰箱中保存。
五、注意事项
1. 质粒提取量与细菌浓度及质粒拷贝数等因素有关，低拷贝质粒或大于10 kb的大质粒提取时应加大细菌使用量。
2. 使用70 ℃预热的Elution Buffer D或ddH2O洗脱质粒DNA，可以提高洗脱效率。
3. 利用新转化的感受态细菌可以提高质粒DNA产量。
4. 洗脱体积不应小于2 mL，否则降低DNA产量。
5. 为了您的健康，实验过程中请穿实验服，并佩戴手套与口罩。
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